《中國生物制品規(guī)程》 凍干黃熱活疫苗制造及檢定規(guī)程

本品系用減毒的黃熱病毒17D株接種雞胚，經(jīng)研磨、離心，取上清液凍干制成。專供進入或經(jīng)過黃熱流行地區(qū)的人員預防黃熱之用。

1　毒種

1.1　毒種來源

減毒黃熱病毒17D株。

1.2　毒種檢定

1.2.1　無菌試驗

按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。

1.2.2　純毒試驗

用已知黃熱病毒免疫血清做中和試驗，證明其為黃熱病毒。

1.2.3　猴體安全及效力試驗

取凍干黃熱17D毒種，加無菌生理鹽水恢復其原液量，接種無黃熱病毒中和抗體之恒河猴10只，每只腦內注射0.25ml（50000個小白鼠LD50）。注射后第2、4、6日各采血1次，分離血清，分別做10倍系列稀釋。以原血清及10-1～10-3各稀釋度的血清分別腦內注射體重10～12g小白鼠6只，每只0.03ml，觀察21天，檢查病毒量，LD50均不得超過Log2（4天以內死亡的小白鼠不計算在內）。猴子經(jīng)注射后2～4周，再采血1次，分離血清，做中和抗體測定。10只猴中至少要有9只血清表現(xiàn)陽性中和反應。在1個月的觀察期中，發(fā)現(xiàn)腦炎癥狀或因而死亡者不得超過1只猴。

1.3　毒種保存

原毒種和生產(chǎn)毒種批均應凍干后真空封口，保存于-70℃以下。

1.4　毒種傳代和生產(chǎn)毒種的制備

取毒種3支，啟開安瓿后立即以稀釋液（不應含有任何人體蛋白和外源血清或抗體）溶化。待全部溶化后接種于7日齡雞胚卵黃囊，每胚0.2ml。分2組進行，每組不得少于10胚，置37.5～38℃培育。70～80小時按組收取活存雞胚，每組不得少于4胚。去眼后分組混合研磨，加稀釋液做成懸液，經(jīng)2000r/min離心10分鐘，吸取上清液，在雞胚中傳代，并抽樣按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行無菌試驗。按同法連續(xù)傳遞2代，傳代時可不等無菌試驗結果，第3代毒種的雞胚收獲后，吸取容器內液體做無菌試驗（方法同上），并將雞胚凍存于-40℃以下。將無菌試驗陰性之雞胚取出融化。按每胚加入1ml稀釋液研磨，經(jīng)2000r/min離心10分鐘，吸取上清液，加入稀釋液稀釋5倍后置冰浴中待用。同時做毒力滴定。此代即為生產(chǎn)毒種。

2　疫苗制造

2.1　接種雞胚

用7日齡雞胚，每胚接種適當稀釋度毒種液0.1～0.2ml于卵黃囊，接種后滴蠟封口。

2.2　培育

接種后37.5～38℃培育，70～80小時開始收獲。

2.3　收獲

收獲時剔去死胚，分組收獲活存雞胚，去眼，裝入大管中，逐管吸取管內液體做無菌試驗，在操作過程中盛雞胚之大管應置冰浴中保冷，收獲完畢置-40℃凍存。

2.4　研磨、離心

2.4.1　研磨

剔除灑菌雞胚，將冰凍雞胚大管置冷水中融化，倒入研磨桶內，按每胚1ml加入滅菌雙蒸水，用電動研磨機8000r/min研磨3分鐘。

2.4.2　離心，收取上清液

將研磨后的雞胚懸液以減壓虹吸法分裝于500ml瓶中，塞以膠塞，用2000r/min離心30分鐘。離心應在2～5℃進行。

收取上清液，每批裝一個球瓶，換以膠塞，保存在冰浴中。

2.5　半成品檢定

2.5.1　無菌試驗

按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行

2.5.2　凍干前病毒滴定

吸取球瓶中樣品，作10倍系列稀釋。取10-1～10-6之病毒液，每個稀釋度用體重10～12g小白鼠6只，每只腦內注射0.03ml，接種部位忌用碘酒消毒，觀察21天，計算LD50。

2.6　分裝

疫苗保存在冰浴中進行分裝，每安瓿分裝量為0.5ml（10人份）。分裝后將盛安瓿之金屬盒放入-40～-50℃預凍2小時。

2.7　凍干

全部凍干過程為15～17小時，最后5小時升溫20～25℃，最高不得超過25℃。凍干后安瓿真空封口。

3　成品檢定

3.1　物理檢查

外觀為略帶粉紅色的疏松體，水分不應超過3%（g/g），加入稀釋液應迅速溶解。

3.2無菌試驗

按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。

3.3　猴體安全及效力試驗

方法及要求見1.2.3項，如生產(chǎn)毒種做過猴體安全及效力試驗則疫苗可免做。

3.4　豚鼠安全試驗

按原分裝量加入生理鹽水溶解疫苗，用體重300～500g豚鼠2只，試驗前2～3天每天量體溫、稱體重。然后每只腹腔注射0.5ml，觀察7天，每天量體溫，應無病癥發(fā)生。如2只豚鼠均有顯著反應（體溫超過40℃，體重減輕）或死亡，則該批疫苗應廢棄；如有1只豚鼠有癥癥發(fā)生，可再用3只豚鼠重試，重試中如有2只以上豚鼠發(fā)病時，判為不合格，制品應廢棄；如有1只發(fā)病，則再重試，仍有發(fā)病則判為不合格，制品應廢棄。

3.5　病毒滴定

同半成品檢定。每只小白鼠腦內注射0.03ml。病毒滴度應≥3.66LogLD50。

3.6　穩(wěn)定性試驗

由每批疫苗成品取3安瓿，置37℃2周，滴度下降不應超過1Log。

3.7　鑒別試驗

每亞批成品應按1.2.2項進行鑒別試驗。

3.8　稀釋液

氯化鈉注射液，其質量應符合《中國藥典》規(guī)定。

4　保存與效期

應保存于-20℃，自干燥之日起效期為1年半，如保存于2～8℃，效期為6個月。