《中國生物制品規(guī)程》 凍干基因工程α2a干擾素制造及檢定規(guī)程

本品系用帶有人α2a型干擾素基因重組質(zhì)粒的大腸桿菌，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)及單克隆抗體親和層析后精制而成。用于治療某些病毒性疾病及部分腫瘤疾病。

1　菌種

1.1菌種來源

基因工程α2a干擾素工程菌由帶有人α2a干擾素基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌而來。投產(chǎn)的工程菌需經(jīng)衛(wèi)生部批準(zhǔn)。

1.2菌種特性

菌種表達(dá)穩(wěn)定，表達(dá)水平符合投產(chǎn)菌種要求。

1.3制造用菌種庫的建立

從原始菌種庫傳出，經(jīng)擴(kuò)大后凍干保存，或由上一代制造用菌種庫傳出，擴(kuò)大后凍干保存作為制造用菌種庫，但每次只限傳三代。每批制造用菌種庫均進(jìn)行下列檢定，合格后方可投產(chǎn)。

1.3.1劃種LB瓊脂平板

應(yīng)呈典型大腸桿菌集落形態(tài)，無其他雜菌生長。

1.3.2涂片革蘭氏染色

在光學(xué)顯微鏡下觀察，應(yīng)為典型的革蘭氏陰性桿菌。

1.3.3對(duì)抗生素的抗性

應(yīng)與原始菌株相符。

1.3.4電鏡檢查

應(yīng)為典型大腸桿菌形態(tài)，并證明無支原體、病毒樣顆粒及其他微生物污染。

1.3.5生化反應(yīng)

應(yīng)符合大腸桿菌生物學(xué)性狀。

1.3.6干擾素的表達(dá)量

在搖床培養(yǎng)，應(yīng)符合原始菌種的表達(dá)量。

1.3.7質(zhì)粒檢查

應(yīng)做該質(zhì)粒的酶切圖譜，并應(yīng)與原始質(zhì)粒相符。

1.3.8表達(dá)的干擾素型別

應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)抗α干擾素血清做中和試驗(yàn)，證明型別正確。

1.4生產(chǎn)菌種

從制造用菌種庫傳出供生產(chǎn)用的菌種，稱為生產(chǎn)菌種。

1.4.1生產(chǎn)菌種的制備及檢定

取制造用菌種庫凍干菌種開啟后劃種LB平板2～3塊，培養(yǎng)后挑取平板中5～10個(gè)菌落，分別培養(yǎng)后保存，然后每個(gè)菌落分別進(jìn)行干擾素表達(dá)量測定，至少重復(fù)一次，選出其中干擾素表達(dá)量最高的一份，供生產(chǎn)制備種子液用，其表達(dá)量應(yīng)符合原始菌種的表達(dá)量。

1.5種子液

從生產(chǎn)菌種選出的菌種供做發(fā)酵用的稱“種子液”。種子液的制備：將1.4.1項(xiàng)檢定合格的生產(chǎn)菌種，根據(jù)實(shí)際需要做擴(kuò)充傳代，作為罐培養(yǎng)的種子液。

2　發(fā)酵培養(yǎng)

2.1空罐滅菌和實(shí)罐滅菌嚴(yán)格按照使用說明書要求操作。

2.2發(fā)酵培養(yǎng)基

應(yīng)為適于發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基，根據(jù)菌種的抗生素抗性，培養(yǎng)若中允許加入少量抗生素，但應(yīng)盡量避免含有β椖邗０防囁股亍?/P>

2.3發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)

根據(jù)工程菌和發(fā)酵工藝要求設(shè)置和變換各項(xiàng)培養(yǎng)參數(shù)。

3　收集菌體

用離心法或其他適宜方法收集菌體，菌體可在?/FONT>20℃下保存1年。

4　菌體裂解

用鹽酸胍或溶菌酶或高壓勻漿泵等適宜方法裂解菌體。

5　制備粗制干擾素

菌體裂解后經(jīng)離心所得上清液即為粗制干擾素。

6　純化

粗制干擾素經(jīng)單克隆抗體親和層析等純化步驟后即精制成“干擾素半成品原液”。

7　加白蛋白

取干擾素半成品原液檢定合格后，立即另入適量人白蛋白保護(hù)劑，即為“加人白蛋白半成品”，保存于?/FONT>30℃。

8　稀釋、除菌過濾

將“加人白蛋白半成品”用無熱原生理鹽水稀釋至所需濃度，補(bǔ)加人白蛋白，使最終含量1%～2%。然后用0.22μm孔徑濾膜除菌，除菌后抽樣進(jìn)行干擾素效價(jià)測定，熱原質(zhì)試驗(yàn)和無菌試驗(yàn)，合格后進(jìn)行分裝凍干。

9　分裝、凍干

9.1　每支安瓿分裝1ml，內(nèi)含α2a干擾素100或300萬IU。

9.2　凍干過程制品溫度不得超過33℃。

9.3　凍干后成品置10℃以下干燥處保存，成品檢定合格后進(jìn)行包裝。

10　半成品檢定

每批半成品抽樣進(jìn)行10.1～10.8項(xiàng)檢定。啟開新菌種生產(chǎn)的前3批或生產(chǎn)條件有較大改變時(shí)進(jìn)行10.9～10.12項(xiàng)檢定。

10.1　效價(jià)測定

用細(xì)胞病變抑制法，Wish細(xì)胞/VSV為基本檢測系統(tǒng)，用國家參考品校準(zhǔn)為IU。

10.2　蛋白含量

用Lowry法測定。

10.3　比活性

應(yīng)≥108Iumg蛋白。

10.4　純度

10.4.1　電泳純度

用非還原型SDS?/FONT>PAGE法，加樣量不低于5μg，經(jīng)掃描儀掃描純度應(yīng)在95%以上，聚合體不得超過10%。

10.4.2　高效液相色譜純度

用280nm檢測，應(yīng)是一個(gè)吸收峰或主峰占總面積95%以上。

10.5　分子量

用還原型SDS?/FONT>PAGE法，加樣量不低于5μg，α2a干擾素分子量應(yīng)為19KD±10%。

10.6　殘余外源性DNA含量

用同位素或生物素標(biāo)記探針法測定，每劑量中殘余外源性DNA應(yīng)低于100pg。

10.7　殘余鼠IgG含量

用酶標(biāo)或其他敏感方法測定，每劑量（20μg）的鼠IgG含量應(yīng)在100ng以下。

10.8　殘余工程菌蛋白含量

用酶標(biāo)或其他敏感方法測定，殘余工程菌蛋白不得超過總蛋白的0.02%。

10.9　殘留抗生素活性

半成品中不應(yīng)有殘余抗生素活性存在。

10.10　肽圖測定

應(yīng)符合α2a型干擾素圖形，批與批之間圖形應(yīng)一致。

10.11　等電聚集

測定等電點(diǎn)，α2a型干擾素等電點(diǎn)應(yīng)5.7～6.7范圍內(nèi)。

10.12　紫外光譜掃描

檢查半成品的吸收光譜，批與批之間應(yīng)一致，α2a干擾素的最大吸收光譜應(yīng)為280±3nm。

11　除菌半成品檢定

11.1　效價(jià)測定

同10.1項(xiàng)。

11.2　無菌試驗(yàn)

按《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。

11.3　熱原質(zhì)試驗(yàn)

按《生物制品熱原質(zhì)試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行，注射劑量按家兔體重注射20萬IU/kg，判定標(biāo)準(zhǔn)按該規(guī)程4.1項(xiàng)要求進(jìn)行。

12　成品檢定

12.1　外觀

應(yīng)為白色或微黃色疏松體，另入1ml滅菌注射用水溶解后，不得含有肉眼可見的不溶物。

12.2　pH值

pH值應(yīng)為6.5～7.5。

12.3　效價(jià)測定

同10.1項(xiàng)。其效價(jià)應(yīng)為標(biāo)示量的80%～150%。

12.4　水分含量

應(yīng)≤3%（g/g）。

12.5　鑒別試驗(yàn)

用中和試驗(yàn)法，其抗病毒活性能被抗α2a型干擾素血清所中和或用免疫印染法。

12.6　HBsAg檢測

用敏感度為1ng/ml以下的試劑盒測定，應(yīng)為陰性。

12.7　無菌試驗(yàn)

同11.2項(xiàng)，每批抽樣不少于10支。

12.8　熱原質(zhì)試驗(yàn)

同11.3項(xiàng)。

安全試驗(yàn)

12.9.1　豚鼠試驗(yàn)

用體重300～400g豚鼠2只，每只腹側(cè)皮下注射干擾素1ml，觀察7天，局部無紅腫、壞死、體重增加者為合格。

12.9.2　小白鼠試驗(yàn)

用體重18～20g小白鼠5只，每只腹腔注射干擾素0.5ml，觀察7天，動(dòng)物全部存活，每只體重增加判為合格。

13　保存與效期

保存于10℃以下干燥處。自效價(jià)檢定合格之日起效期為2年6個(gè)月。