《中國生物制品規(guī)程》 傷寒、副傷寒甲二聯(lián)菌苗制造及檢定規(guī)程

本品系用傷寒、副傷寒甲菌培育后取菌苔制成懸液，加甲醛殺菌，以磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋成每ml含傷寒1.5億菌，副傷寒甲1.5億菌制成。用于預(yù)防傷寒、副傷寒甲。

1　菌種

1.1　菌種來源

制造傷寒、副傷寒甲二聯(lián)菌苗用的菌種及檢定菌種用的診斷血清，應(yīng)由中國藥品生物制品檢定所分發(fā)或經(jīng)同意。

1.2菌種檢定

檢定菌種可用pH7.2～7.4的肉湯瓊脂、馬丁瓊脂或其他適宜的培養(yǎng)基。

1.2.1培養(yǎng)特性

制造菌苗的菌株應(yīng)具有的典型的形態(tài)、培養(yǎng)和生化特性。

1.2.2血清凝集試驗(yàn)

用37℃培養(yǎng)18～20小時(shí)的培養(yǎng)物以磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋成含菌6億/ml，與相應(yīng)的傷寒、副傷寒甲菌診斷血清作定量凝集試驗(yàn)，搖勻后37℃過夜，以肉眼見到凝集（+）之血清最高稀釋度為凝集反應(yīng)之效價(jià)。凝集價(jià)不應(yīng)低于血清原效價(jià)之半。并用傷寒Vi及O血清做凝集試驗(yàn)，應(yīng)與Vi血清有凝集，與O血清不凝集，或僅有較低凝集。

1.2.3毒力試驗(yàn)

用37℃培育12～16小時(shí)的瓊脂培養(yǎng)物以生理鹽水稀釋，傷寒稀釋成6億/ml、3億/ml、1.5億/ml及0.75億/ml，副傷寒甲稀釋成15億/ml、7.5億/ml及3.75億/ml等濃度的菌液（根據(jù)菌種毒力情況可作更改也可增加稀釋度）。

第一稀釋度菌懸液腹腔注射體重14～16g小白鼠至少5只，每只0.5ml，觀察3天，使小白鼠于感染后3天內(nèi)全部死亡的最小劑量為1個(gè)致死量（LD），傷寒菌種1LD應(yīng)不超過1.5億菌，副傷寒甲菌種不超過7.5億菌。

1.2.4毒性試驗(yàn)

用37℃培育18～20小時(shí)瓊脂培養(yǎng)物混懸于磷酸鹽緩沖生理鹽水內(nèi)，56℃加溫1小時(shí)（或其他方法殺菌），不加防腐劑。殺菌試驗(yàn)合格后稀釋成每ml含菌60、30及15億共3個(gè)濃度，每一濃度的菌懸液以0.5ml腹腔注射體重15～18g小白鼠5只，觀察3天，注射7.5億菌之小白鼠應(yīng)全部生存，注射15億菌的5只小白鼠可有3只死亡。

1.2.5免疫力試驗(yàn)

按《傷寒、副傷寒甲、乙三聯(lián)菌苗制造及檢定規(guī)程》1.2.5項(xiàng)進(jìn)行。

1.2.6抗原性試驗(yàn)

選體重2kg左右之健康家兔至少3只，用免疫力試驗(yàn)所用之菌液靜脈注射3次，每次0.5ml，第1次注射7億菌，第2次14億菌，第3次21億菌，每次間隔7天。末次注射后10～14天采血做定量凝集試驗(yàn)測定效價(jià)。傷寒菌免疫的血清對(duì)免疫菌效價(jià)應(yīng)不低于1∶12800，副傷寒甲效價(jià)不低于1∶6400，2/3家兔血清之凝集價(jià)達(dá)上述要求即為合格。

1.3菌種保存

菌種應(yīng)凍干保存，凍干菌種保存于2～8℃。

菌種凍干后應(yīng)抽取樣品按1.2.2項(xiàng)進(jìn)行檢查，合格后可使用3年。以后每次生產(chǎn)前必須檢查全部特性一次，合格者可繼續(xù)使用2年。

2　菌苗制造

制造傷寒、副傷寒甲二聯(lián)菌苗所用的每一菌種選用2個(gè)菌株。

2.1菌種

凍干菌種啟開后檢查菌形、純度及進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)（傷寒菌加用Vi血清），合格后即可使用。每啟開1支凍干菌種用于生產(chǎn)不超過6代。

2.2制造用培養(yǎng)基

用pH7.2～7.4的馬丁瓊脂或其他適宜的培養(yǎng)基。

2.3原液制造

2.3.1接種

采用涂種，接種后置37℃培育18～24小時(shí)。

2.3.2采集

采集前應(yīng)逐瓶檢查，有雜菌者廢棄。刮取菌苔混懸于磷酸鹽緩沖生理鹽水中。

2.3.3純菌試驗(yàn)

原液采集后應(yīng)逐瓶取樣接種瓊脂斜面1管，于37℃培育2天，24～26℃1天，有雜菌生長應(yīng)廢棄。

2.3.4殺菌

原液用甲醛溶液殺菌，各種原液加入甲醛溶液濃度如下：

傷寒菌原液不超過1.1%±0.1%（ml　/ml）。

副傷寒甲菌原液不超過1.4%±0.1%(ml　/ml)。

加殺菌劑后的原液應(yīng)放在37℃，不得超過7天，以后保存于2～8℃。

2.3.5無菌試驗(yàn)

純菌試驗(yàn)合格的原液，應(yīng)取樣接種不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基及普通瓊脂斜面各1管，放37℃培育5天，有本菌生長，可加倍量復(fù)試一次；有雜菌生長應(yīng)廢棄。

2.3.6原液合并

無菌試驗(yàn)合格之原液，安不同菌株或不同制造日期分別過濾合并，合并后應(yīng)加不超過0.5%(g/ml)的苯酚或其他適宜之防腐劑，保存于2～8℃。

2.4原液檢定

2.4.1鏡檢

菌形應(yīng)正常，無雜菌。

2.4.2凝集試驗(yàn)

原液與相應(yīng)血清進(jìn)行凝集試驗(yàn)，其凝集效價(jià)不應(yīng)低于血清原效價(jià)之半。

2.4.3無菌試驗(yàn)

按《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。

2.4.4濃度測定

應(yīng)按中國細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量檢定部門會(huì)同測定濃度。

2.4.5免疫力試驗(yàn)

原液于無菌試驗(yàn)合格后與質(zhì)量檢定部門會(huì)同進(jìn)行。抽驗(yàn)批數(shù)應(yīng)不少于生產(chǎn)批數(shù)的1/5。方法同1.2.5項(xiàng)，唯所用小白鼠每組至少15只。對(duì)傷寒或副傷寒甲毒菌之攻擊，均應(yīng)保護(hù)60%小白鼠活存為合格。

2.5原液保存

原液應(yīng)保存于2～8℃。原液自采集之日起至用于菌苗稀釋時(shí)不得少于4個(gè)月，保存效期自采集之日起為2年半。

2.6菌苗稀釋

2.6.1原液配合

稀釋前應(yīng)先將不同菌種所制之原液按比例配合。每一種菌所加的菌數(shù)與應(yīng)加菌數(shù)在總菌數(shù)不變的原則下，允許兩種菌之間在20%的范圍內(nèi)互有增減；同一種菌不同菌株之原液按等量混合，但每個(gè)菌株所加的菌數(shù)與應(yīng)加菌數(shù)在總菌數(shù)不變的原則下，允許兩個(gè)菌株之間在40%范圍內(nèi)互有增減。

2.6.2菌苗稀釋

稀釋菌苗用含0.25%～0.5%（g　/ml）苯酚或其他適宜的防腐劑之磷酸鹽緩沖生理鹽水。

2.6.3菌苗濃度

菌苗每ml含傷寒菌1.5億，副傷寒甲菌1.5億。

2.7菌苗分批

同組配合的原液用同批稀釋液在同一日稀釋的各瓶菌苗為1批。大罐稀釋時(shí)應(yīng)按大罐分批，并按分裝機(jī)分為亞批。

2.8檢定

稀釋后每批應(yīng)逐瓶抽樣進(jìn)行無菌試驗(yàn)及測定防腐劑含量（大罐稀釋時(shí)除外）。

2.9分裝

分裝后應(yīng)每亞批抽樣送質(zhì)量檢定部門進(jìn)行成品檢定。

3　成品檢定

3.1物理化學(xué)檢查

菌苗應(yīng)為乳白色懸液，pH值為6.8～7.4。不應(yīng)有搖不散的菌塊或異物。苯酚含量應(yīng)為0.25%～0.5%（g　/ml）。

3.2菌形及純度

染色鏡檢，應(yīng)為革蘭氏陰性桿菌。至少觀察10個(gè)視野，平均每個(gè)視野內(nèi)不得有10個(gè)以上非典型菌（線狀、粗大或染色可疑桿菌），并不應(yīng)有雜菌。

3.3無菌試驗(yàn)

按《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。

3.4安全試驗(yàn)

3.4.1毒性試驗(yàn)

用體重18～20g之健康小白鼠5只，每只腹腔注射菌苗0.5ml，或用體重350～450g之健康豚鼠2只，腹腔注射菌苗1.5ml，觀察7日，應(yīng)無死亡。

3.4.2防腐劑試驗(yàn)

用體重18～20g之健康小白鼠2只，每只皮下注射菌苗0.5ml，用苯酚作防腐劑的菌苗注射的小白鼠可發(fā)生戰(zhàn)栗癥狀，但不應(yīng)超過半小時(shí)，觀察7日不得有局部膿腫或死亡。

4　保存與效期

應(yīng)保存于2～8℃。自稀釋之日起效期為1年半。如原液保存超過1年稀釋，應(yīng)相應(yīng)縮短效期（自原液采集之日起總效期不得超過2年半）。