禽流感疫病原快速檢測技術的研究進展

點評專家：張鶴曉（北京出入境檢驗檢疫局動物檢驗檢疫中心主任）

“現(xiàn)在國內(nèi)有些人談禽流感而色變，甚至不再吃與禽類相關的食物。對于禽流感我們要重視但不用恐懼它。”張鶴曉在接受記者采訪時，侃侃而談，“因為早在2001年我們就開始禽流感技術的研究并獲得成功。不但把檢測時間從原來的3周縮短到4小時，而且實現(xiàn)了養(yǎng)殖場環(huán)境的安全控制?！?/p>

據(jù)介紹，過去由于禽肉中禽流感病毒的快速檢測技術沒解決，對禽流感檢測最常用的方法是世界動物衛(wèi)生組織推薦的雞胚病毒分離法。由于檢測約需3周時間，加上樣品需要一定的前期處理過程，無法保證進出口禽肉在短時間內(nèi)通過檢疫后通關。雞胚病毒分離法不但不適應我國進出口活禽及產(chǎn)品的快速檢驗、快速通關放行需要，也不適應國內(nèi)消費者對禽肉安全性需求以及禽流感防控工作中對疫情的早發(fā)現(xiàn)和早確診。

“建立快速、敏感、特異的禽流感診斷技術并應用到實際防治工作中去，才能真正解決‘一線’急需?！睆堹Q曉鄭重地告訴記者。

把疫情扼殺在搖籃中

2003年底，韓國、日本、越南、泰國等相繼爆發(fā)禽流感，并波及到10多個國家和地區(qū)。我國自2004—2005年初報告發(fā)生禽流感疫情以來，內(nèi)地確診禽流感的地區(qū)涉及16個省份。禽流感給我國的養(yǎng)禽業(yè)造成重大損失，不僅危害養(yǎng)雞業(yè)，而且重創(chuàng)了部分地區(qū)的養(yǎng)鴨場和養(yǎng)鵝場。

高致病性禽流感的發(fā)生往往是突如其來的，發(fā)生后迅速蔓延，因此一旦發(fā)生后的防控工作非常艱巨，因此，必須對疫情早發(fā)現(xiàn)、早確診，并“把它扼殺在搖籃中”，禽流感病毒的快速檢測技術，包括病毒的快速檢出和快速定型被列入“十五”科技攻關課題，并迅速獲得成功，投入了實際應用。

課題組根據(jù)全球禽流感病毒流行特點和規(guī)律，先后建立了熒光RT-PCR快速檢測禽流感通用型、H5亞型、H7亞型、H9亞型方法，成功研制出4種禽流感病毒檢測試劑盒。在檢測靈敏度與雞胚病毒分離基本一致的情況下，將原來所需的21天檢測時間縮短為4小時，禽流感疫情的早發(fā)現(xiàn)、早確診，進出口活禽及禽類產(chǎn)品的快速檢測，快速通關終于成為了現(xiàn)實。在2005年的中美禽流感高層論壇上，美方專家為我國有此先進檢測技術感到驚訝，因為美國也剛剛將此技術作為美國禽流感病毒快速檢測的首選方法。

課題組自主研發(fā)的試劑盒通過了國內(nèi)權威部門所做的臨床試驗和符合試驗，于2005年2月取得了國家“一類新獸藥”證書，這表明該試劑盒在當時為國內(nèi)外首創(chuàng)，這也是我國檢驗檢疫系統(tǒng)唯一的“一類新獸藥”；課題組還制定了《禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測方法》、《H5亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測方法》等四項國家標準，并于2004年2月15日由國家質檢總局和標準化管理委員會公開發(fā)布。

敏感、特異又安全

禽流感檢測技術不但要快速，還要非常敏感，只有靈敏地檢測出污染了禽流感病毒的環(huán)境已經(jīng)被非常徹底地消毒了，才能避免再次進入其中的禽類一旦感染再次爆發(fā)疫病的可能。課題組研發(fā)的檢測技術實現(xiàn)了敏感、特異和安全性。

在動物的臟器中，病毒含量較多，肌肉中病毒含量相對較少，課題組研發(fā)的檢測技術，由于采用了特異性的熒光探針和高靈敏度的熒光PCR儀，使該方法比傳統(tǒng)的PCR方法靈敏度高100—1000倍，即使是把發(fā)病的雞肉稀釋1萬倍，也能檢測出所含的微量禽流感病毒；快速檢測技術采用了特異性的引物和探針，其特異性高于傳統(tǒng)PCR方法，使它只限于檢測禽流感病毒，不能檢測其他病毒，避免了病毒交叉反應而造成的檢測誤差；快速檢測技術還很安全，由于檢測是在殺死病毒后進行的，并且不對病毒進行增值，病毒不會擴散，在常規(guī)實驗室里都可以進行，而雞胚病毒分離法必須在生物安全3級實驗室里才能進行，應用快速檢測技術的實驗室范圍大大擴大，成本也大量減少。

課題組還首次建立了2種敏感、特異的多重熒光RT-PCR檢測法。多重熒光RT-PCR同單管反應相比，不僅提高效率，而且節(jié)約了成本。經(jīng)大量研究驗證建立了禽流感病毒H5/N1多重熒光RT-PCR檢測方法，實現(xiàn)了一次反應中確定病毒是否為H5N1亞型；此外，通過將H5亞型和H7亞型檢測引物和探針進行正交試驗，經(jīng)優(yōu)化后，建立了禽流感病毒H5/H7亞型多重熒光RT-PCR檢測方法，實現(xiàn)了一次反應中確定病毒是否為H5或H7亞型。2004年2月，禽流感快速檢測技術被科技部列為向全國首批推薦為22項禽流感防治技術之一。已經(jīng)推廣應用試劑盒30萬余頭份，創(chuàng)造了較好的經(jīng)濟效益。在應用本試劑盒對出口禽類進行檢測3年多以來，我國出口的禽產(chǎn)品從未被進口國檢出禽流感病毒，不但為養(yǎng)殖企業(yè)和廣大養(yǎng)殖戶創(chuàng)造了良好的經(jīng)濟效益，還支持了6億多美元的出口創(chuàng)匯。

至今，該試劑盒已在全國20多個出入境檢驗檢疫局、20多家檢疫機構和24個出口大型養(yǎng)殖企業(yè)及7個省、地級獸醫(yī)站得到應用，有些人醫(yī)疾病預防控制中心也采用了該技術來預防和檢測人感染禽流感。

解決的關鍵技術

課題組解決了禽肉中微量禽流感病毒的快速檢驗檢疫技術難題。該技術比常規(guī)RT-PCR和膠體金技術靈敏度高100-1000倍，其誕生有力地促進了禽肉進出口貿(mào)易，大大降低了進出口禽肉攜帶禽流感病毒的風險。

解決了由于禽流感病毒亞型多，亞型檢測技術分別對樣品檢測較復雜的問題。建立了首先用禽流感病毒通用快速檢測技術進行檢測，然后對陽性樣品進行分型的禽流感病毒檢驗檢疫模式；解決了養(yǎng)禽場禽流感快速診斷技術問題，為養(yǎng)禽場禽流感的快速診斷進而采取相應防治措施，減少經(jīng)濟損失提供了好方法。目前為止，僅課題組就已為100多個養(yǎng)禽場做出準確、快速診斷。

為國家質檢總局對日本交涉提供了依據(jù)。針對某公司出口鴨肉被日本檢出禽流感病毒問題，國家質檢總局派調查組應用熒光RT-PCR檢測禽流感病毒技術，從采集的138份樣品中檢測出一份樣品禽流感病毒H5亞型陽性，后用雞胚分離出禽流感病毒，為質檢總局決策提供了依據(jù)。雖然如今禽流感感染的速度在加快，宿主的范圍也在擴大，但總體來說病毒感染人的數(shù)量很少，只有極少數(shù)接觸禽流感病毒的人才會得病。但我們一定要重視禽流感問題，人們盡量不要接觸活禽，特別是有病的禽類，比如北京去年就已經(jīng)取消了活禽市場。為了避免人流感病毒和禽流感病毒的交叉混合感染，導致新的亞型產(chǎn)生，患了流感的病人尤其要注意不要接觸活禽和野生鳥類。