《細(xì)胞和分子免疫學(xué)》 一、生物活性檢測法

細(xì)胞因子生物學(xué)活性檢測法是根據(jù)某些細(xì)胞因子特定的生物學(xué)活性，應(yīng)用相應(yīng)的指示系統(tǒng)和標(biāo)準(zhǔn)品來反映待測標(biāo)本中某種細(xì)胞因子的活性水平，一般以活性單位來表示。生物學(xué)檢測法一般敏感性較高，直接表示待測標(biāo)本中的活性水平。但實驗周期較長，如集落形成法需10～14；易受細(xì)胞培養(yǎng)中某些因素的影響，如血清、pH、藥物；易受生物學(xué)活性相同或相近的其它細(xì)胞因子的影響，如檢測IL-2時可受IL-4的干擾，TNF-α和TNF-β（淋巴毒素）表現(xiàn)出極為相似的生物學(xué)作用；易受待栓樣品中某些細(xì)胞因子抑制物的干擾，如IL-1活性可被IL-1受體拮抗物（IL-1ra）所抑制，TNF-α可被TNF-BP所阻斷；不能區(qū)分某些細(xì)胞因子的型和亞型，如IFN-α、β和γ，以及IFN-α中不同的亞型顯示相同的生物學(xué)活性；某些指示細(xì)胞長期培養(yǎng)易發(fā)生突變；不同指示細(xì)胞對同一種細(xì)胞因子的敏感性不同，所慕名而來結(jié)果難于標(biāo)準(zhǔn)化；此外，某些人源的細(xì)胞因子如hIL-2對小鼠細(xì)胞起作用，但鼠源性的IL-2對人的細(xì)胞則無刺激作用。

生物學(xué)檢測的方法大致可分為增殖或增殖抑制、集落形成、直接殺傷靶細(xì)胞、保護靶細(xì)胞免受病毒攻擊、趨化作用以及抗體形成法等幾類。

（一）增殖或增殖抑制法

其基本原理是應(yīng)用某一細(xì)胞因子能特異地刺激或抑制某些指示細(xì)胞的增殖，通過3H-TbR摻入或MTT法顯色，反映待檢細(xì)胞因子的活性水平。

（二）集落形成法

其基本原理是應(yīng)用骨髓干細(xì)胞體外半固體培養(yǎng)系統(tǒng)，根據(jù)不同造血因子能誘導(dǎo)干細(xì)胞或定向造血祖細(xì)胞形成某一種或某些種類細(xì)胞的集落，通過對形成集落形態(tài)學(xué)、酶學(xué)鑒定，計算不同種類集落形成的數(shù)量和比例，反映待測標(biāo)本中CSF的種類和活性水平。

（三）直接殺傷靶細(xì)胞

在細(xì)胞因子中TNF-α、TNF-β具有直接殺傷某些腫瘤細(xì)胞的作用，采用TNF敏感的細(xì)胞株如小鼠成纖維細(xì)胞株L929，以及WEHI164亞克隆13作為指示細(xì)胞，通過3H-TdR釋放法或染料染色等可檢測待檢樣品中TNF的活性水平。

（四）保護靶細(xì)胞免受病毒的攻擊

靶細(xì)胞受某些病毒感染后可發(fā)生明顯病變和死亡，干擾素可保護靶細(xì)胞免受病毒的攻擊，常用的病毒是水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis virus,VSV）,敏感的指示細(xì)胞為喉癌的上皮細(xì)胞株Hep2和羊膜的上皮細(xì)胞WISH，通過干擾素（IFN-α、IFN-β、IFN-γ）抑制病毒致病變的程度，計算出待測樣品中IFN的活性單位。

（五）趨化作用

IL-8對多形核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞具有趨化作用，可用小室法或軟瓊脂趨化法，PMN或淋巴細(xì)胞作為指示細(xì)胞，以細(xì)胞趨化的程度來反映樣品中IL-8活性水平。

（六）抗體形成法

IL-6可在體外刺激某些B淋巴細(xì)胞系產(chǎn)生和分泌免疫球蛋白，常用的指示細(xì)胞有分泌IgG的ARH-77、CESS和分泌IgM的SKW6.CL-4。在一定的條件下，待檢樣品中IL-6水平與培養(yǎng)細(xì)胞上清IgG或IgM水平正相關(guān)，通過標(biāo)準(zhǔn)IL-6的對照可推算出待檢樣品中IL-6的活性。

表4-22　細(xì)胞因子生物學(xué)活性檢測方法（舉例）

被檢細(xì)胞因子實驗系統(tǒng)可干擾的因素IL-1D.10（小鼠T細(xì)胞）增殖法（3H-TdR、MTT）人IL-2；小鼠IL-2、IL-4、IL-7、GM-CSF、TNF等小鼠胸腺細(xì)胞增殖法TGF-β1、β2抑制作用IL-4（小鼠胸腺瘤）CTLL轉(zhuǎn)換法（增殖法）小鼠IL-4黑素瘤細(xì)胞A352增殖抑制法IL-2CTLL（小鼠殺傷性T細(xì)胞系）增殖法小鼠IL-4IL-3KG1（髓樣白血病細(xì)胞）增殖法TF-1（前髓樣細(xì)胞）增殖法EPO、IL-5、IL-6、GM-CSF小鼠造血細(xì)胞系FDCP-1增殖法GM-CSF人巨核母細(xì)胞白血病細(xì)胞系Mo7E增殖法GM-CSF、IL-9骨髓半固體造血祖細(xì)胞集落形成20α類固醇脫氫酶GM-CSF集落種類和數(shù)量GM-CSF、IL-1、IL-6、G-CSF、M-CSFIL-4小鼠B細(xì)胞誘導(dǎo)CD23、MHCⅡ類IFN-γ有抑制作用抗原表達PHA刺激的小鼠T細(xì)胞增殖法IL-2IL-4依賴細(xì)胞株增殖法IL-2人IL-4R轉(zhuǎn)染CTLL增殖法IL-2

續(xù)表1

被檢細(xì)胞因子實驗系統(tǒng)可干擾的因素IL-5抗Ig（或SAC）刺激B細(xì)胞誘導(dǎo)人或小鼠骨髓半固體培養(yǎng)中嗜酸性粒細(xì)胞成熟增殖法IL-3抗Ig處理的小鼠B細(xì)胞IgM分泌BCL-1（B淋巴瘤細(xì)胞）增殖法IL-4IL-6TF-1（前髓樣細(xì)胞）增殖法EPO、IL-3、IL-5、GM-CSFB9（小鼠雜交瘤細(xì)胞）增殖法小鼠IL-4、IL-117TD1（小鼠雜交瘤細(xì)胞）增殖法IL-11BM60增殖法HepG2（肝細(xì)胞）Fibronogen產(chǎn)生LIFCESS（EBV轉(zhuǎn)化人B細(xì)胞）IgGβ1、TGF-β2有抑制作用DKW6.CL-4IgM產(chǎn)生TGFβ1、TGF-β2有抑制作用IL-7骨髓前B細(xì)胞增殖法IL-8中性粒細(xì)胞軟瓊脂趨化法其它化學(xué)趨化物質(zhì)小室趨化法G-CSF、M-CSFIL-9Mo7E（巨核細(xì)胞白血病系）增殖法IL-3、GM-CSFIL-117TD1（小鼠雜交瘤細(xì)胞系）增殖法IL-6B9（小鼠雜交瘤細(xì)胞系）增殖法小鼠IL-4、IL-6T1165增殖法IL-6IL-12PBMCIFN-γ產(chǎn)生IFNα/β/γPHA活化T淋巴母細(xì)胞增殖法IL-2、IL-4PBLLAK殺傷（與IL-2協(xié)同）IL-2、IL-6骨髓祖細(xì)胞GM集落形成IL-3；TGF-β有抑制作用TF-1（前髓樣細(xì)胞）增殖法EPO、IL-3、IL-5、IL-6小鼠造血細(xì)胞FDCP-1增殖法IL-3人巨核母細(xì)胞白血病細(xì)胞系Mo7E增殖法IL-3、IL-9AML-193增殖法造血祖細(xì)胞粒細(xì)胞集落形成IL-3、IL-9中性粒細(xì)胞活化后超氧釋放GM-CSFWEHI164亞克隆13或L929殺傷作用GM-CSF、IL-6TNF-α和TNF-β（LT）有相似的殺傷作用

續(xù)表2

被檢細(xì)胞因子實驗系統(tǒng)可干擾的因素PDGF成纖維細(xì)胞和SS、WHG、WI26、WI28增殖法FGF（1、2、5）、EGF、TGF-β、IL-1、TNF等INF-α/β/γ上皮細(xì)胞如Hep-2、Wish抵抗病毒（如VSV）的致病變作用FN-α/β/γ有相似的生物學(xué)活性TGF-β成纖維細(xì)胞（半固體培養(yǎng)）增殖法成骨細(xì)胞單層培養(yǎng)增殖法PHA刺激PBMC增殖抑制法ConA/IL-1誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞增殖抑制法IL-2、IL-4人黑素瘤細(xì)胞A375增殖抵制法IL-1、IL-2、IL-4