《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)》 四、遺傳工程與近交系的發(fā)展

遺傳工程是70年代興起的一門嶄新的科學(xué)技術(shù)，它使人類進(jìn)入了定向控制生物遺傳性狀的新階段。

所謂遺傳工程也就是根據(jù)人們的意愿，采用工程建筑的手法，按照預(yù)先設(shè)計(jì)的方案，借助于實(shí)驗(yàn)室手段將一個(gè)生物體的遺傳物質(zhì)定向地轉(zhuǎn)移到另一個(gè)生物體中去，使后者獲得人類希望的性狀，成為一個(gè)新的“物種”。這們就打破了傳統(tǒng)的、必須經(jīng)過兩性雜交的育種方法，使原來(lái)在自然狀態(tài)下根本不可能發(fā)生有性繁殖的兩種生物的基因結(jié)合在一起了。

遺傳工程的概念可分為廣義的和狹義的兩種。廣義的遺傳工程包括細(xì)胞工程、染色體工程和基因工程三類，使用的是細(xì)胞生物學(xué)方法和分子生物學(xué)方法，包括細(xì)胞融合、細(xì)胞拆合、染色體導(dǎo)入和基因或DNA分子的轉(zhuǎn)移等。廣義的遺傳工程又稱為微生物工程或細(xì)胞工程。狹義的遺體工程僅限于基因工程。

早期的遺傳工程的研究工作大多數(shù)是在病毒、噬菌體和細(xì)菌中進(jìn)行的。因?yàn)檫@些生物的遺傳物質(zhì)比較簡(jiǎn)單，容易搞清楚遺傳物質(zhì)與生物性狀之間的關(guān)系。隨著知識(shí)的積累，技術(shù)的提高，現(xiàn)在越來(lái)越多的遺傳工程實(shí)驗(yàn)開始在高等哺乳類動(dòng)物身上進(jìn)行了。這尤其促進(jìn)了近交系小鼠的發(fā)展。

（一）細(xì)胞工程與近交系小鼠的發(fā)展

1．嵌合體小鼠（Mouse　Aggregation　Chimeras）的育成。嵌合體小鼠技術(shù)是由Tarkowski和Mintz分別在華沙和費(fèi)城發(fā)展的（見圖3-5）。他們首先用兩對(duì)不同品系的近交系小鼠在同一時(shí)刻進(jìn)行純交，為了使其后代便于區(qū)分，常選擇毛色不同品種的近交系小鼠例如選用白毛的SJL小鼠與黑毛色的BL/10小鼠。當(dāng)受精卵分裂為8分裂球時(shí)，分別將它們從各自母體的子宮上分離下來(lái)。然后用蛋白酶消化分裂球外面的明帶，使分裂球“裸露”。并在37℃的條件下，將來(lái)自兩個(gè)品種的兩個(gè)分裂球彼此接觸，任其粘成一個(gè)具有雙倍體積的早期胚胎。將早期胚胎繼續(xù)培養(yǎng)到具有128～256個(gè)細(xì)胞的胚囊。這時(shí)，不同毛色品系的細(xì)胞相互混雜發(fā)育在一起。然后，通過手術(shù)把胚囊移植到寄養(yǎng)母鼠的子宮內(nèi)，讓它繼續(xù)發(fā)育，直至出生。新生小鼠長(zhǎng)出毛后，其毛色表現(xiàn)為既不象父親SJL品系的全白色，也不象母系BL/10品系的全黑色，而是表現(xiàn)出黑、白條或塊狀的毛色。這說(shuō)明新生鼠的組織是由“黑色”細(xì)胞和“白色”細(xì)胞嵌合而成的，是一只嵌合體小鼠。

圖3-5　嵌合小鼠育成

近交同類系動(dòng)物也是近交系動(dòng)物，它除了一小段帶有可辯的目的基因染色體外，在遺傳上與原來(lái)已建立起來(lái)的那個(gè)近交系完全一致。近交同類系動(dòng)物的培育，是選用帶有目的基因的個(gè)體與已經(jīng)建立起來(lái)的近交系雜交建立起的。應(yīng)用近交同類系動(dòng)物可以研究多基因系統(tǒng)中一個(gè)基因的特殊作用，施耐爾博士（Snell）是第一個(gè)應(yīng)用這種體系進(jìn)行組織移植基因研究的，建立了同類抵抗系學(xué)說(shuō)，為小鼠的主要組織相容性抗原的研究做出了巨大貢獻(xiàn)，為此獲得了1981年的諾貝爾獎(jiǎng)金。

同類系動(dòng)物的命名基于如下兩種方式。一種是帶有近交品系和供體品系的復(fù)合符號(hào)，中間帶有一點(diǎn)，例：B6·AKR。第二種命名法是近交品系后面加上一橫，然后標(biāo)上供體品系特異的基因位點(diǎn)的符號(hào)。這樣B6·AKR也可以寫作B6-H-2k。對(duì)于最近培育的同類系，小鼠遺傳標(biāo)準(zhǔn)命名委員會(huì)建議同時(shí)采用兩種方式，這樣B6·AR或B6-H-2k應(yīng)該寫為B6·AKR-H-2k。

如果進(jìn)一步研究嵌合體小鼠的其它性狀，還可以發(fā)現(xiàn)嵌合體小鼠將雙親的各種不同的性狀都嵌合起來(lái)了。例如Mintz(1967，1971)證明用DBA/2和C3H兩種不同品種的近交系所嵌合的后代具有不同的異檸檬酸脫氫酶（IDH-1）或蘋果酸脫氫酶（MDH），利用電泳技術(shù)可以將它們彼此分開。除了雙親具有的酶以外，嵌合體內(nèi)有時(shí)還可以發(fā)現(xiàn)第三種酶，即雙親的“雜種”或異多聚酶。以上的工作對(duì)于細(xì)胞水平的遺傳性研究是具有重要意義的，受到人們?cè)絹?lái)越多的重視。

嵌合體小鼠近年來(lái)已應(yīng)用于細(xì)胞和組織的動(dòng)力學(xué)研究，如研究小腸上皮細(xì)胞移行規(guī)律及其定位等。

2．單親純合雙倍體動(dòng)物的育成。單親純合雙倍動(dòng)物育成技術(shù)又稱為雌核發(fā)育技術(shù)。這是一種相當(dāng)于植物中由花粉培育成純合雙倍體植株的技術(shù)，其結(jié)果都是培育出具有兩套完全一致的染色體及基因的個(gè)體。

眾所周知，不論在生產(chǎn)上還是在科學(xué)試驗(yàn)中都需要純系動(dòng)物。為了得到一個(gè)純系動(dòng)物，一般要花費(fèi)數(shù)年時(shí)間，甚至一生的光陰。既使對(duì)世代周期較短的小鼠，采用了最有效的兄妹交配方法，還需要連續(xù)兄妹交配20代以上才能獲得純系動(dòng)物，這也要幾年時(shí)間。如果采用單親純合雙倍體育成的技術(shù)來(lái)育成一個(gè)純系動(dòng)物，則將大大地縮短育種周期，小鼠只需三周，牛也只需幾個(gè)月。具體方法見圖3-6。

圖3-6　單親雙位體動(dòng)物育成（雌核發(fā)育）

首先將兩個(gè)不同品系的的近交系進(jìn)行雜交（例如SJLXBL/10），交配后，在精核與卵核尚未融合之前，從母鼠子宮內(nèi)沖取受精卵并用極細(xì)的吸管將雄核去掉。然后在細(xì)胞松馳素B的處理下使雌核加倍，形成二倍體細(xì)胞，二倍體細(xì)胞在體外繼續(xù)培養(yǎng)到胚囊期后，移植到養(yǎng)母的子宮內(nèi)使胚胎繼續(xù)發(fā)育，直至出生。一般選擇毛色與雙親不同的品系作為養(yǎng)母，以易于區(qū)分。本例中是選擇毛色為野生色的BL/10XSJL雜交鼠作為養(yǎng)母的。養(yǎng)母本身沒有經(jīng)過交配，因而出生的小鼠均為移植進(jìn)去的胚胎發(fā)育而成，它表現(xiàn)出親母鼠純合的性狀。若出生的新生鼠表現(xiàn)為野生色，則說(shuō)明實(shí)驗(yàn)技術(shù)失敗，并未剔除精核。

單親純合雙倍體技術(shù)也已在魚類和家兔中獲得成功。

3．細(xì)胞核移植系的產(chǎn)生。在單親純合雙倍體育成技術(shù)中已提到了核移植技術(shù)，但這僅是該技術(shù)的初步。若能將受精卵中的精核，與卵核都移出，然后再將來(lái)自其它細(xì)胞新核移入受精卵，并能順利地完成新胚胎的正常發(fā)育，核移植技術(shù)就算成功了。以前，完整的核移植技術(shù)僅在兩棲類和昆蟲中取得成功。1981年日內(nèi)瓦大學(xué)的伊爾曼斯（K.Illmensee）和美國(guó)杰克遜研究所的霍普（P.C.Hoppe）首次在小鼠中完成了核移植技術(shù)，開創(chuàng)了哺乳動(dòng)物核移植成功的先例。具體方法見圖3-7。

圖3-7細(xì)胞移植系的產(chǎn)生

（1）將內(nèi)細(xì)胞塊細(xì)胞里的核用吸管吸出。

（2）將取出的核輸?shù)搅硪粋€(gè)精核與卵核尚未融合的受精卵內(nèi)。

（3）吸出該受精卵本身的精核與卵核。

（4）受精卵在體外發(fā)育到胚胎細(xì)胞。

（5）將胚盤細(xì)胞移植到白色的養(yǎng)母小鼠的子宮內(nèi)。

（6）出生的小鼠長(zhǎng)出灰毛，說(shuō)明細(xì)胞移植系實(shí)驗(yàn)成功。

（1）首先用灰色的小鼠品系進(jìn)行雌雄交配（也可用其它毛色的品系），從母體的子宮內(nèi)獲得胚盤細(xì)胞。胚盤細(xì)胞包括營(yíng)養(yǎng)外胚葉細(xì)胞和內(nèi)細(xì)胞塊細(xì)胞兩種，后者將來(lái)可形成胚胎。若錯(cuò)誤地取了營(yíng)養(yǎng)外胚葉細(xì)胞就要導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

（2）用極細(xì)的吸管取出內(nèi)細(xì)胞塊細(xì)胞的細(xì)胞核，并將它注到剛受精的、但卵核與精核尚未融合的黑色小鼠的受精卵內(nèi)。

（3）從黑色小鼠的受精卵內(nèi)取出吸管時(shí)，將黑色鼠受精卵原有的卵核和精核吸出。

（4）將處理過的受精卵在體外培養(yǎng)到胚盤細(xì)胞期，再將它移植到白色的養(yǎng)母小鼠的子宮內(nèi)，讓它繼續(xù)發(fā)育。

（5）產(chǎn)出的新生小鼠必須會(huì)長(zhǎng)出灰色的毛，這就是細(xì)胞核移植鼠。

由于主要的遺傳物質(zhì)存在于細(xì)胞核中，所在核移植的受體將具有與核移植供體完全相同的遺傳基礎(chǔ)。因此，細(xì)胞核移植系技術(shù)在動(dòng)物育種工作中具有十分重要的意義。因?yàn)樗笾参镏械慕M織培養(yǎng)那樣，可以利用一頭優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物（例如高產(chǎn)的奶牛）復(fù)制出與它生得完全一樣的成千上萬(wàn)的細(xì)胞核移植系動(dòng)物。

（二）實(shí)驗(yàn)小鼠染色體工程進(jìn)展

所謂染色體工程是以染色體為單位進(jìn)行有意識(shí)的切割、修補(bǔ)或成條、成套地增加，將人類需要的遺傳性狀集中在一起，創(chuàng)造出新的物種。以往的染色體工程一般均采用物理的或化學(xué)的方法。在高等動(dòng)物中，由于多倍體或者染色體嚴(yán)重缺失與重復(fù)的個(gè)體都不容易成活，所以高等哺乳動(dòng)物的染色體工程目前均是在細(xì)胞水平上采用細(xì)胞融合技術(shù)進(jìn)行。

Harris和Watkins(1965)首先制備了包含小鼠和人類細(xì)胞的種間異核本。他們將由宮頸癌組織培養(yǎng)出來(lái)的人類HaLa細(xì)胞和小鼠細(xì)胞（生長(zhǎng)在腹膜腔中Ehrlich小鼠腫瘤細(xì)胞）置于同一培養(yǎng)液中，加入經(jīng)紫外線滅活了的仙臺(tái)病毒（Sendai　Virus，是粘病毒的副流感群中的一種）。在仙臺(tái)病毒的作用下使兩種細(xì)胞發(fā)生融合。融合細(xì)胞開始有兩個(gè)來(lái)自不同物種的細(xì)胞核，稱為異核體，這一點(diǎn)可以通過同位素標(biāo)記的方法加以證實(shí)，事先他們用氚標(biāo)記的胸苷來(lái)標(biāo)記HaLa細(xì)胞的細(xì)胞核，而在一個(gè)異核體細(xì)胞內(nèi)，可以發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的和不標(biāo)記的兩個(gè)細(xì)胞核。異核體的兩個(gè)核融合后就可以繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞分裂，并形成單核細(xì)胞系。雜種細(xì)胞大，容易認(rèn)別。它在以后的不斷的分裂過程，人類的一套染色體和小鼠的一套染色體并不是都隨著細(xì)胞的分裂進(jìn)行復(fù)制的。在正常的條件下，人類的染色體將隨著細(xì)胞的分裂而逐漸丟失。這種丟失是隨機(jī)的。所以最后形成的雜種細(xì)胞往往都是帶有一整套小鼠染色體加上不同數(shù)目和不同編號(hào)的人類染色體（或帶有絲粘的片斷），由于現(xiàn)代染色技術(shù)發(fā)展，使人們不僅可根據(jù)染色的結(jié)果很容易地區(qū)分人類染色體與小鼠染色體，而且可以確定在雜種細(xì)胞中留下來(lái)的是哪一條或者哪幾條人類染色體。

如果使用的小鼠細(xì)胞是營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞，即細(xì)胞本身不能合成某種必需營(yíng)養(yǎng)物，只有在培養(yǎng)液中添加了這種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后細(xì)胞才能正常地生長(zhǎng)。小鼠營(yíng)養(yǎng)缺陷型根據(jù)其所需的不同種營(yíng)養(yǎng)物有許多不同的種類。如果將某種小鼠營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞與人類正常細(xì)胞融合，形成雜種細(xì)胞。這時(shí)小鼠的營(yíng)養(yǎng)缺陷可由于人類染色體上的有關(guān)基因的存在，該種生存必需營(yíng)養(yǎng)物得到彌補(bǔ)，雜種細(xì)胞在不添加該營(yíng)養(yǎng)液中的也能正常生長(zhǎng)。經(jīng)過一段時(shí)期培養(yǎng)，保留下來(lái)的細(xì)胞除帶有一整套小鼠染色體外，至少還穩(wěn)定地保留了一條與該營(yíng)養(yǎng)物合成有關(guān)的人類染色體。如果我們使用多種營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞作為遺傳標(biāo)志，就可有得到許多不同的雜種細(xì)胞，通過分析比較，就可能確定在人類的遺傳中那種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成的基因在哪一條染色體。我們不僅可以用營(yíng)養(yǎng)缺陷基因作為標(biāo)志，還可以采用生化、免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)有關(guān)的基因作為標(biāo)志基因，這樣就可以把決定嘌呤酶的基因，決定各種碳水化合物、氨基酸以及脂肪代謝的基因，氨基酰-tRNA合成的基因，遺傳性疾病的基因（例如白內(nèi)障、指甲髕骨發(fā)育不全），對(duì)白喉和脊髓灰質(zhì)炎等毒素易感性基因，細(xì)胞表面抗原基因和多肽酶基因等作為標(biāo)志基因，結(jié)果就可以完成對(duì)更多的基因染色體定位工作。現(xiàn)在已定位在人類染色體的基因數(shù)目已超過了210個(gè)，對(duì)人類遺傳學(xué)的研究作出了很大的貢獻(xiàn)。

（三）實(shí)驗(yàn)小鼠基因工程進(jìn)展

超級(jí)小鼠的產(chǎn)生。1982年末Palmiter和Brister報(bào)導(dǎo)，他們把小鼠MT-1基因的啟動(dòng)子與大鼠生長(zhǎng)激素（GH）基因結(jié)合，制成融合基因（MGH），然后將MGH插入到大腸桿菌的質(zhì)粒中，擴(kuò)增，備用；把收獲的MGH基因注入小鼠受精卵的雄性前核；然后將這些受精卵移植到養(yǎng)母小鼠的子宮內(nèi)，直至分娩。

結(jié)果在出生的21只小鼠中有7只帶有MGH基因，6只小鼠的每個(gè)細(xì)胞均有兩個(gè)以上的MGH（多的可達(dá)35個(gè)）。在攜帶MGH的小鼠肝細(xì)胞中檢出的MGH-mRNA數(shù)目高達(dá)3000個(gè)血液中生長(zhǎng)激素濃度明顯增高，表明MGH基因已得到表達(dá)。含有兩個(gè)以上MGH基因的6只小鼠，生長(zhǎng)迅速，個(gè)別的為正常小鼠的兩倍，成為所謂的“超級(jí)小鼠”。含有MGH基因的小鼠與普遍小鼠雜交的結(jié)果，子代19只小鼠中有10只含有MGH基因。MGH基因可以從親代向子代遞這一事實(shí)說(shuō)明MGH基因已整合到小鼠染色體上去了。

最近也有人報(bào)導(dǎo)了利用人類的生長(zhǎng)激素基因使小鼠成為超級(jí)小鼠的。超級(jí)小鼠的育成，開創(chuàng)了基因工程在哺乳類動(dòng)物中獲得成功的首例。它對(duì)于醫(yī)學(xué)和畜牧業(yè)的發(fā)展有著極其深遠(yuǎn)的意義和廣闊的前景。