丁公藤的作用

丁公藤堿降眼壓作用機(jī)制的研究

中華眼科雜志1999年第3期第35卷 青光眼

作者：曾淑君　張延斌　彭大偉　伍宇平　余克明　周文炳

單位：曾淑君　張延斌　伍宇平(510089廣州,中山醫(yī)科大學(xué)藥理教研室)；彭大偉　余克明　周文炳(中山醫(yī)科大學(xué)中山眼科中心)

關(guān)鍵詞：丁公藤堿；縮瞳；降眼壓；M受體亞型；環(huán)核苷酸

【摘要】　目的　探討丁公藤堿降眼壓作用的分子藥理學(xué)機(jī)制。方法　在恒定光源下用瞳孔尺測(cè)量兔瞳孔直徑,用氣動(dòng)眼壓計(jì)測(cè)量兔眼壓，測(cè)量離體兔虹膜的收縮力，采用放射免疫法測(cè)定房水的環(huán)核苷酸含量。結(jié)果　測(cè)定丁公藤堿縮瞳作用的pD2值為3.60±0.15,降眼壓作用的pD2值為3.49±0.07,離體虹膜收縮作用的pD2值為6.38±0.12。M1～M3受體拮抗劑均可拮抗丁公藤堿的縮瞳作用、降眼壓作用及離體虹膜收縮作用,其中以M3受體拮抗劑的拮抗作用最強(qiáng)。0.01％丁公藤堿可使房水環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)含量降低,環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine3,5-monophosphate;cGMP)含量升高。結(jié)論　丁公藤堿的縮瞳和降眼壓作用主要通過(guò)M3受體介導(dǎo)，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制與環(huán)核苷酸系統(tǒng)相偶聯(lián)。

Studies of the mechanism of lowering intraocular pressure on Erycibele alkaloid

ZENG Shujun,ZHANG Yanbin,PENG Dawei,et al.Department of Pharmacology,Sun Yat-sun University of Medical Sciences,Guangzhou510089

【Abstract】　Objective　To investigate the molecular pharmacological mechanism of lowering intraocular pressure of Erycibele alkaloid.Methods　Rabbit pupil diameter was measured by a pupillary ruler in constant illumination and the intraocular pressure(IOP)was measured by pneumatonometer.Iris contracting force was measured in an experiment of isolated rabbit iris.Radioimmune method was used to determine the content of cyclonucleotide.Results　The pD2value(the affinity to M-receptors of agonist)of Erycibele alkaloid's miosis is3.60±0.15and its IOP lowering action is3.49±0.07.In the isolated iris contracting experiment,its pD2value is6.38±0.12.M3receptor antagonist is the strongest antagonist in inhibiting the miosis,IOP lowering action and isolated iris pupillary contracting action of Erycibele alkaloid.0.01%Erycibele alkaloid can cause the decrease of cAMP and the increase of cGMP in the aqueous humor.Conclusions　The effects of miosis and IOP lowering of Erycibele alkaloid are all mediated by M3receptor subtype and its signal transductive mechanism is connected with cyclic nucleotide system.

【Key words】　Erycibele alkaloid　Miosis　IOP lowering　Muscarinic receptor subtype　Cyclic nucleotide

以毛果蕓香堿(pilocarpine)為代表的擬膽堿藥是一類歷史悠久、效力較強(qiáng)的抗青光眼藥物,均為毒蕈堿受體(muscarinic receptor,M受體)的激動(dòng)劑,其降眼壓作用機(jī)制尚未完全明了。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是直接興奮睫狀肌的縱行肌，牽引鞏膜嵴，開大小梁網(wǎng)間隙，增加房水外流（用于開角型青光眼）［1，2］；直接興奮虹膜括約肌，引起縮瞳，減少虹膜在房角的堆積，開放房角，恢復(fù)房水的正常循環(huán)（用于閉角型青光眼）。1987年，Bonner等［3］應(yīng)用分子克隆技術(shù)，證實(shí)了M受體的5個(gè)亞型，分別命名為M1～M5受體。M受體興奮后，可通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)機(jī)制發(fā)揮作用。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制主要有3個(gè)方面：（1）激活磷酰脂肌醇(phosphatidylinostal，PI)；（2）抑制腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase,AC)或激活鳥苷酸環(huán)化酶(guanylate cyclase,GC)；（3）離子通道(ionic channal)的變化，但至今各M受體亞型的確切信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚未闡明。1992年Gabelt和Kaufman［4］的研究證實(shí)毛果蕓香堿對(duì)猴眼的房水外流、調(diào)節(jié)痙攣及縮瞳作用均通過(guò)M3受體介導(dǎo)。

丁公藤堿(erycibele alkaloid)是我國(guó)特有的應(yīng)用于臨床的抗青光眼中草藥，具有與毛果蕓香堿相同作用的M受體激動(dòng)劑［5-7］。但丁公藤堿作用于哪個(gè)M受體亞型？又通過(guò)哪些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制發(fā)揮其降眼壓作用？為探討丁公藤堿的分子藥理學(xué)機(jī)制，我們進(jìn)行了以下研究。

材料和方法

一、縮瞳、降眼壓實(shí)驗(yàn)

1.瞳孔的測(cè)定:將兔固定于箱內(nèi),于恒定強(qiáng)度的光線下，用瞳孔尺測(cè)定瞳孔直徑。

2.眼壓測(cè)定:將兔固定于箱內(nèi)，安靜半小時(shí),用0.4%丁氧普魯卡因進(jìn)行眼球表面麻醉,用氣動(dòng)眼壓計(jì)(美國(guó)Digilab model30R-T pneuma-tonometer)測(cè)量眼壓,重復(fù)測(cè)量3次,取其平均值,記錄眼壓曲線。

3.給藥方法:將兔的1只眼滴入平衡鹽溶液100μl作為空白對(duì)照，另1只眼滴入某一濃度丁公藤堿100μl，分別于滴眼后30min、1、2、3、4、5及6h測(cè)定雙眼瞳孔大小和眼壓變化,選取瞳孔縮小和眼壓下降最大值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,每一濃度丁公藤堿滴用10只兔眼，共5個(gè)濃度50只兔眼。2周后,對(duì)照眼仍滴用平衡鹽溶液作為空白對(duì)照；實(shí)驗(yàn)眼先給予4%pirenezepine(M1受體拮抗劑),30min后,再滴入不同濃度的丁公藤堿,方法同上；觀察家兔雙眼6h內(nèi)的瞳孔大小及眼壓變化。另取100只兔，將4%pirenzepine改為2%gallamine(M2受體拮抗劑)或0.4%4-單磷酸脫氧腺苷(deoxyadenosine monophosphate,DAMP)(M3受體拮抗劑)重復(fù)上述實(shí)驗(yàn),即可獲得各亞型拮抗劑拮抗丁公藤堿對(duì)眼壓和瞳孔的藥效變化。

4.以各累積劑量的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),相應(yīng)累積效應(yīng)為縱坐標(biāo)繪圖,可獲得S形曲線,按改良Lineweaver-Burk公式使之直線化,求得解離常數(shù)(KD)和最大效應(yīng)(Emax)。將所得數(shù)據(jù)通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件,求得丁公藤堿的pD2值(激動(dòng)劑解離常數(shù)的負(fù)對(duì)數(shù),表示激動(dòng)劑對(duì)M受體的親和力)和各亞型拮抗劑的pA2值(競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑解離常數(shù)的負(fù)對(duì)數(shù),表示拮抗劑對(duì)M受體的親和力)。

二、離體虹膜實(shí)驗(yàn)

靜脈注射空氣處死家兔,迅速摘出雙眼球,置于冷Ringer-Locke營(yíng)養(yǎng)液中，細(xì)心分離出完整虹膜,按虹膜內(nèi)等腰三角形三頂端各穿一線,底邊二線連于通氣鉤上,另一端連于拉力換能器上,負(fù)荷500mg，平衡1h后,制作不同濃度丁公藤堿虹膜累積量效收縮曲線，然后沖洗虹膜3次，分別加入M1受體亞型拮抗劑pirenzepine,M2受體亞型拮抗劑gallamine和M3受體亞型拮抗劑4-DAMP,其分子質(zhì)量濃度均為10mol/L，共0.2ml，平衡30min后,再重復(fù)不同濃度的丁公藤堿,記錄收縮曲線,以各累積劑量的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),相應(yīng)累積效應(yīng)為縱坐標(biāo)繪圖,得S形曲線,按改良Lineweaver-Burk公式使之直線化,求得KD和Emax。將所得數(shù)據(jù)通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件,求得丁公藤堿的pD2值和各亞型拮抗劑的pA2值。

二、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制

M受體興奮之后,其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制是加速磷酰脂肌醇的代謝,抑制腺苷酸環(huán)化酶,激活鳥苷酸環(huán)化酶,或者引起離子通道的改變［9，10］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0.01%的丁公藤堿可引起房水cAMP含量的下降，丁公藤堿激活了M受體之后，與抑制性G蛋白（Gi或Go）相偶聯(lián)，抑制腺苷酸環(huán)化酶使cAMP含量下降；另一方面又與相應(yīng)的G蛋白（如Gq）相偶聯(lián)，增強(qiáng)磷酰脂肌醇的代謝，生成二?；视停―AG），激活鳥苷酸環(huán)化酶，提高細(xì)胞內(nèi)cGMP水平，說(shuō)明丁公藤堿降眼壓的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制是通過(guò)環(huán)核苷酸系統(tǒng)。

尋找療效高、副作用小和選擇性強(qiáng)的M受體亞型的擬膽堿藥是青光眼藥理學(xué)的重要課題。目前我們僅就丁公藤堿與M受體亞型的關(guān)系及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行了初步探討。今后尚待進(jìn)一步精確地闡明眼前段組織中M受體亞型的分布、功能及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為指導(dǎo)臨床用藥、尋找藥效更強(qiáng)、副作用更小的膽堿能抗青光眼新藥提供理論依據(jù)。

本課題受國(guó)家自然科學(xué)基金(基金編號(hào)39570753)和廣東省自然科學(xué)基金(基金編號(hào)940225)資助

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