砷劑對腫瘤細胞的誘導(dǎo)凋亡作用

作者：宋鐵芳

砷劑，主要成分為三氧化二砷（As2O3），在祖國醫(yī)藥中被稱為砒石。幾世紀以前，砷劑就被人們用來治療牛皮癬、風(fēng)濕癥、白血病、梅毒、痔瘡等。目前臨床上砷劑的應(yīng)用主要限于用有機砷治療錐蟲病或三氧化二砷作牙髓失活劑。

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)首先報道了靜脈滴注As2O3治療復(fù)發(fā)的急性早幼粒細胞白血?。ˋPL）達到很高的完全緩解率后，上海血液研究所發(fā)現(xiàn)As2O3可誘導(dǎo)APL細胞凋亡和部分分化。近年來，國內(nèi)外對砷劑與腫瘤的研究發(fā)展很快，發(fā)現(xiàn)砷劑對惡性淋巴系統(tǒng)疾病、紅白血病甚至實體瘤有令人振奮的治療效果?，F(xiàn)就其生化作用及對腫瘤的誘導(dǎo)凋亡作用作一綜述。

1　砷的生化作用

砷作為微量元素，存在于正常人體內(nèi)。其化學(xué)形式可分為三價砷(無機砷)和五價砷(有機砷)，它們在體內(nèi)的相互轉(zhuǎn)換和代謝決定著砷的毒性作用。三價砷毒性較大，易在體內(nèi)蓄積，主要經(jīng)胃腸道緩慢排泄;而五價砷則相對毒性較低，蓄積傾向低，主要經(jīng)腎臟較快排泄。進入人體后的三價砷在肝臟內(nèi)還原發(fā)生甲基化，形成一甲胂酸(MMA)或二甲胂酸(DMA)，從而被解毒。

砷是一種細胞原漿毒，細胞內(nèi)的相鄰巰基是三價砷的主要化學(xué)受體。應(yīng)用含巰基的還原型谷胱甘肽可阻斷砷劑的毒性作用。含大量巰基的還原型角蛋白結(jié)合砷劑的量為含較少巰基的氧化型角蛋白結(jié)合砷劑量的十倍。砷劑與酶分子內(nèi)的巰基作用后可抑制其活性。受影響的重要酶系統(tǒng)有丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、磷酸酯酶、細胞色素氧化酶、脫氧核糖核酸聚合酶、白介素1β轉(zhuǎn)化酶（ICE）等，從而直接影響了細胞的代謝過程、染色體結(jié)構(gòu)、核分裂等。

線粒體是對砷劑作用最敏感的細胞器，三價砷消耗了線粒體內(nèi)親水的巰基后，干擾了線粒體內(nèi)的離子平衡以及NAD(P)H的氧化，從而干擾了線粒體的能量代謝，引起細胞功能的紊亂。砷劑是否對正常細胞有毒性作用取決于劑量，如As2O3治療APL有效血濃度及體外研究其對腫瘤細胞作用的有效濃度均在0.1μM～2.0μM，實驗表明As2O3在此濃度下對造血干細胞影響甚小[1]。

2　砷劑對腫瘤細胞的誘導(dǎo)凋亡作用

與正常細胞不同，腫瘤細胞生長失控，分化或凋亡受阻。近年來研究表明砷劑既可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、部分分化，也可抑制其增殖。多項研究表明誘導(dǎo)凋亡為其殺傷腫瘤細胞的主要機制。

2.1　開放MPT，活化caspase家族

研究表明，細胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)不在細胞核而在細胞質(zhì)。雖然凋亡細胞呈現(xiàn)一系列的特征性形態(tài)學(xué)變化，但這些改變僅僅是細胞凋亡的結(jié)果。凋亡細胞在被誘導(dǎo)產(chǎn)生特征性形態(tài)學(xué)改變和DNA降解之前，一個最普遍的變化是線粒體膜功能的改變即線粒體的通透性改變(permeability transition，PT)，這是調(diào)節(jié)凋亡的中心環(huán)節(jié)。線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔道(MPT)是位于線粒體內(nèi)外膜之間的多蛋白復(fù)合體，至少包括胞質(zhì)的己糖激酶、外膜的PBR、外室的肌酸激酶、內(nèi)膜的ANT及基質(zhì)的親環(huán)蛋白D（cyclophilin D）等。

MPT通過調(diào)節(jié)線粒體基質(zhì)中的Ca2＋、pH和電荷，維持線粒體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，保證氧化磷酸化通路通暢，對凋亡控制具有重要作用。砷劑與巰基結(jié)合后，導(dǎo)致MPT開放，線粒體跨膜電位(△ψm)下降或消失，繼之呼吸鏈脫偶聯(lián)，谷胱甘肽耗竭，活性氧類（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生及對誘導(dǎo)凋亡非常重要的蛋白酶活化物的釋放，包括細胞色素C(Cyto-C)和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)，

Cyto-C和 AIF均可激活caspase，caspase可誘導(dǎo)凋亡。

caspase即半胱氨酸蛋白酶家族。在NB4（一種APL細胞系），U937及SHSY5Y成神經(jīng)細胞瘤等細胞系中均可見As2O3等砷劑誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)的caspase激活[2，3]。根據(jù)其在細胞凋亡中的作用可分為始動(上游)caspase(caspase2，8，9，10)和效應(yīng)(下游)caspase(caspase3，6，7)兩大類。前者在凋亡誘導(dǎo)信號作用下結(jié)合特異輔因子而活化，并進一步活化后者。而caspase抑制劑(ZVAD，fmk等)可阻止砷劑誘導(dǎo)的凋亡。因而caspase的活化級聯(lián)形式是砷劑誘導(dǎo)凋亡的重要通路。綜上所述，砷劑引起的MPT開放和△ψm破壞是決定細胞生存與否的關(guān)鍵，而caspase是砷劑誘導(dǎo)凋亡的下游效應(yīng)物，其活化可誘導(dǎo)細胞凋亡。

2.2　改變細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)

細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和抗氧化代謝的平衡往往是決定細胞生存與否的關(guān)鍵。蛋白的氧化作用可能是改變核基因轉(zhuǎn)錄的重要步驟，氧化作用通過基因轉(zhuǎn)錄改變細胞的表型以便進一步啟動凋亡的發(fā)生，且凋亡的最后階段需要氧化過程的參與，如細胞膜蛋白的氧化能開放離子通道間接地導(dǎo)致細胞皺縮，通過組蛋白的氧化修飾作用導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)的改變。砷劑可使細胞內(nèi)ROS生成增多是由于：

（1）MPT開放，線粒體內(nèi)氧化呼吸鏈受阻，致ROS外漏。

（2）活化黃素蛋白依賴的超氧化物酶（如NADPH氧化酶），使H2O2產(chǎn)生增多，后者可通過從線粒體釋放Cyto-C，活化caspase-3并裂解多聚ADP核糖多聚酶(PARP)而介導(dǎo)凋亡（PARP在DNA受損時可識別并結(jié)合到DNA斷裂處被激活而參與DNA的修復(fù)，是細胞凋亡中第一個被鑒定為由caspase-3降解的DNA修復(fù)酶）；又可通過與線粒體巰基形成復(fù)合物而降低GSH的活性等途徑使ROS清除減少。故砷劑可通過改變細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)誘導(dǎo)凋亡。但將細胞培養(yǎng)于氧濃度低于10ppm不可能產(chǎn)生ROS的條件下，仍可發(fā)生凋亡，故這可能只是機制之一。

2.3　快速調(diào)變PMLRARα融合蛋白的亞細胞定位

APL細胞特征性染色體易位t(15;17)導(dǎo)致早幼粒細胞白血病基因(PML)和維甲酸受體α基因(RARα)融合，表達PML-RARα融合蛋白。通過轉(zhuǎn)基因小鼠實驗可證實PML-RARα融合蛋白是APL發(fā)病的主要分子基礎(chǔ)。體外研究表明，PML-RARα融合蛋白既阻斷APL細胞的分化，也使APL細胞凋亡受阻。早期認為砷劑通過降解此蛋白而誘導(dǎo)APL細胞凋亡，稱之為維甲酸受體信號通路[4]。

正常血細胞中野生型PML與RARα等共定位于核體(PODs)中。大多數(shù)APL細胞因PML-RARα與PML形成異二聚體而使PODs結(jié)構(gòu)解體，阻止細胞分化及抑制凋亡。砷劑使PML，PML-RARα重新共定位于PODs并快速降解之。該現(xiàn)象與APL細胞凋亡以及二硫鍵還原劑二硫蘇糖醇(DTT)抑制NB4細胞凋亡與抑制PML-RARα快速降解在時相上均有一定的相關(guān)性，被認為是砷劑治療APL的機制之一。

但有實驗顯示[5]，在PML－小鼠(不含PML基因的小鼠)，As2O3同樣能抑制細胞增殖及誘導(dǎo)凋亡，且其誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)不僅見于APL細胞，還可見于非霍奇金淋巴瘤細胞、慢性淋巴細胞白血病細胞及某些正常細胞，故其誘導(dǎo)凋亡機制是非特異性的，維甲酸受體信號通路并非是砷劑誘導(dǎo)凋亡的惟一機制。

2.4　抑制Bcl-2基因

Bcl-2基因即細胞淋巴瘤/白血病-2基因是研究最早的與凋亡有關(guān)的基因[6～9]，是一種凋亡抑制基因，又稱長壽基因，是維持癌細胞無限制生長的主要基因。Bcl-2家族包括Bcl-2、Bax、Bcl-X、Bcl-w、Bak、Bad、A1、NR-13和Mcl-1，其中Bax、Bak、Bcl-Xs是促凋亡因子，其余為抗凋亡因子。Bcl-2對細胞周期無明顯影響，而對細胞死亡的干擾有選擇性，阻止了細胞死亡的最后途徑，包括核苷酸內(nèi)切酶對DNA的降解。Bax是Bcl-2的一種同源蛋白，Bax既可以形成同聚體，又可與Bcl-2形成異二聚體，Bax蛋白與Bcl-2蛋白的比值影響著細胞受到刺激后發(fā)生凋亡的比率。

目前認為，Bcl-2家族促凋亡因子和抗凋亡因子的相對表達水平至少部分決定了細胞對凋亡信號的反應(yīng)性。大量實驗表明，Bcl-2與Bcl-X l能夠抑制MPT開放和維持線粒體△ψm，進而抑制Cyto_C和AIF從線粒體釋放入胞漿并阻斷了ROS的生成，增加胞內(nèi)GSH含量并促進其向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，即有細胞內(nèi)抗氧化作用。在砷劑誘導(dǎo)的NB4、U937及B細胞白血病細胞系LyH7細胞凋亡中Bcl-2表達下調(diào)[10]。

在1.0μM As2O3誘導(dǎo)NB4細胞凋亡時[11],CPP32（caspase3）被激活和降解PARP，同時Bcl-2不僅在mRNA水平而且在蛋白質(zhì)水平均被下調(diào)；而在1.0μM As2O3誘導(dǎo)惡性淋巴性白血病細胞凋亡過程中既無CPP32激活又無Bcl-2調(diào)變，提示砷劑誘導(dǎo)的凋亡中Bcl-2發(fā)揮的作用各異。有實驗表明，2.5μM As2O3[12]使肝癌細胞系Hep201Bcl-2表達明顯下降，而凋亡的促進因子Bax的表達明顯增加，兩種基因表達比例發(fā)生變化。

又有報道，10μM As2O3處理人肝癌QGY-5401、QGY-5403細胞48小時后其Bcl-2基因表達明顯下降，Bax和Fas基因表達明顯增強，Bax蛋白與Bcl-2蛋白比值增加。對Bax、Bcl-Xl等基因是否表達各報道不同[13～15]。Bcl-2的過度表達可抑制砷劑誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)現(xiàn)象，而通過反義技術(shù)使Bcl-2下調(diào)可抑制細胞增殖及促進凋亡。

綜上所述，砷劑可通過對Bcl-2基因的抑制誘導(dǎo)某些腫瘤細胞的凋亡。但As2O3并不影響惡性淋巴瘤細胞及某些成神經(jīng)細胞瘤細胞系Bcl-2（Bcl-Xl）的表達，提示Bcl-2可能不是參與誘導(dǎo)以上細胞凋亡的主要中介。

2.5　抑制NF-κB的活化

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（nuclear factor-κB）是1986年首先于B細胞中發(fā)現(xiàn)的一種結(jié)合于免疫球蛋白κ輕鏈增強子上的核蛋白[16]。在正常情況下，NF-κB與其抑制物IκBα結(jié)合，存在于細胞漿中，IκBα遮蔽著NK-κB的基因定位序列（NLS），NF-κB的生物學(xué)活性不表現(xiàn)出來。當細胞受到外界因素（包括細菌或病毒感染、炎癥細胞因子、TNF、LPS、紫外線照射、電離輻射）等刺激時，IκBα將發(fā)生磷酸化并迅速降解，NF-κB就被釋放、激活并轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)調(diào)控一系列的基因表達。其中，NF-κB在腫瘤細胞中發(fā)揮著重要的抗凋亡作用，因此，抑制腫瘤細胞NF-κB的活性將引起腫瘤細胞的凋亡，從而抑制腫瘤的生長。有研究表明[17]，As2O3可強烈抑制HTLV-1和HTLV-2（human T-cell leukemia virus type1,2）細胞的IκBα磷酸化，使NF-κB不能進入細胞核中，即抑制了NF-κBN的活化。啟動子為NF-κB依賴性的抗凋亡蛋白Bcl-X1的表達也因此而下調(diào)?！鳓譵下降及Cyto-C的釋放導(dǎo)致caspase-3激活，進而誘導(dǎo)了HTLV-1和HTLV-2這兩種對大多數(shù)凋亡誘導(dǎo)劑有抵抗作用的細胞發(fā)生凋亡。可見，抑制NF-κB的活性也是砷劑誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的機制之一。

2.6　使胞質(zhì)Ca2＋濃度升高

Zhang等[18]發(fā)現(xiàn)以As2O3處理胃癌細胞系MGC803時，胞質(zhì)Ca2＋濃度升高與MGC803細胞凋亡呈平行關(guān)系，且兩者對As2O3呈時間、劑量依賴性。推測砷可能通過以下機制改變胞質(zhì)Ca2＋濃度：

（1）由于膜表面的Bcl-2相關(guān)蛋白具有陽離子選擇性通道的功能，Bcl-2能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核和線粒體水平影響Ca2＋的亞細胞分布。因而，砷等凋亡信號對Bcl-2的抑制作用使Ca2＋通道開放，胞質(zhì)Ca2＋濃度升高；

（2）細胞內(nèi)ROS活性升高及砷劑直接作用于細胞內(nèi)鈣離子轉(zhuǎn)位酶的巰基均可使胞內(nèi)外Ca2＋平衡失控；（3）線粒體△ψm下降使得Ca2＋吸收逆轉(zhuǎn)，導(dǎo)致Ca2＋由線粒體轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體內(nèi)Ca2＋耗竭可直接或通過加強線粒體內(nèi)氧化應(yīng)激而導(dǎo)致細胞凋亡，而且，鈣離子本身作為一種凋亡信號，可調(diào)節(jié)鈣離子敏感的關(guān)鍵酶如蛋白激酶、磷脂酶、核酸內(nèi)切酶及谷氨酰氨轉(zhuǎn)移酶等誘導(dǎo)凋亡。

細胞凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是當前研究的熱點，探討砷劑對腫瘤的誘導(dǎo)凋亡作用很有意義，將為砷劑應(yīng)用于臨床提供堅實的理論基礎(chǔ)。

參考文獻:

[1]Shen ZX,Chen GQ,Ni JH,et al.Use of arsenic trioxide(As2O3)in the treatment of acute promyelocytic leukemia(APL):Ⅱ.clinical efficacyand pharmacokinetics in relapsed patients[J].Blood,1997，89:3354－3360.

[2]Soignet SL,Maslak P,Wang ZG,et al.Complete remission after treatment of acute promyelocytic leukemia with arsenic trioxide[J].New EnglJ Med,1998,339(19):1341－1348.

[3]Akao Y,Nakagawa Y,Akiyama K.Arsenic trioxide induces apoptosisin neuroblastoma cell lines through the activation of caspase3in vitro[J].FEBS Lett,1999,455(1～2):59－62.

[4]Look AT.Arsenic and apoptosis in the treatment of acute promyelocytic leukemia[J].J Natl Cancer Inst,1998，90(2):86－88.

[5]Wang ZG,Rivi R,Delva L,et al.Arsenic trioxide and melarsoprol in duce programmed cell death in myeloid leukemia cell lines and function in a Pmland PMLRARα independent manner[J].Blood,1998，92:1497－1504

.

[6]王劍明，鄒倩，鄒聲泉.Bcl2基因在阻塞性黃疸大鼠肝組織細胞凋亡中作用的研究[J].世界華人消化雜志，1999，7（12）:1035－1037.

[7]喬慶，吳金生，張靜，等.凋亡相關(guān)基因bcl2,bax在人類大腸腺癌中的表達意義[J].世界華人消化雜志，1999，7（11）:936－938.

[8]李雪莉，郝遠瑞，鄒建湘，等.Cmyc,Bcl2與胃癌生物學(xué)行為和細胞凋亡[J].新消化病雜志，1997，5（12）:773－774.

[9]郭琳瑯，曹長安，王友順，等.Bcl2及相關(guān)蛋白bax在肝臟良惡性病變中的表達[J].新消化病雜志，1997，5（10）:655－656.

[10]Konig A,Wrazkl Z,Warrell RP,et al.Comparative activity of melarsoprol and arsenic trioxide in chronic Bcell leukemia lines[J].Blood,1997,90:562－570.

[11]Chen GQ,Zhu J,Shi XG,et al.In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide(As2O3)in the treatment of acute promyelocytic leukemia:As2O3induces NB4cell apoptosis with downregulation of Bcl2expression and modulation of PMLRAR alpha/Pmlproteins[J].Blood,1996，88(3):1052－1061.

[12]劉鐵夫，梁桃.三氧化二砷影響肝癌細胞系Hep201凋亡的研究[J].黑龍江醫(yī)學(xué)，2001，25（2）：81－82.

[13]劉琳，秦叔逵，陳惠英，等.三氧化二砷選擇性誘導(dǎo)人肝癌細胞凋亡及相關(guān)基因的實驗研究[J].中華肝臟病雜志，2000，8（6）：367－369.

[14]陳惠英，劉文虎，秦叔逵.三氧化二砷對肝癌細胞株凋亡的誘導(dǎo)作用[J].世界華人消化雜志，2000，8（5）：532－535.

[15]徐洪雨，高媛媛，武俏麗，等.三氧化二砷抑制人肝癌細胞株增殖和誘導(dǎo)凋亡作用[J].世界華人消化雜志，2000，8（11）：1233－1237.

[16]劉冰熔.核轉(zhuǎn)錄因子NFκB——腫瘤基因治療的新焦點[J].國外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊，2001，24（3）：129－132.

[17]Mahieux R,PiseMasison C,Gessain A,et al.Arsenic trioxide induces apoptosis in human Tcell leukemia virus type1and type2infected cells by a caspase3dependent mechanism involving Bcl2cleavage[J].Blood,2001，98(13):3762－3769.

[18]Zhang TC,Cao HE,Li JF,et al.Induction of apoptosis and inhibition of human gastric cancermgC803cell growth by arsenic trioxide[J].Eur J Cancer,1999，35(8):1258－1263.