基因工程生產降鈣素研究方興未艾

自1975年開始被用于治療原發(fā)性骨質疏松癥、高血鈣癥、變形性骨炎，緩解急性粉碎性骨折所致的炎癥水腫和劇痛等，降鈣素一直被臨床廣泛應用。降鈣素的生產方法主要有提取法、化學合成法和基因工程法。提取法由于天然原料含量極微、提取工藝復雜，化學法合成法由于成本較高等原因，限制了它們的使用和推廣。

近年來出現(xiàn)的用基因工程法對降鈣素基因進行改造、重組及大規(guī)模生產具有重要的現(xiàn)實意義。20世紀90年代末，我國開始了基因工程降鈣素的研究，取得了一些積極進展。

大腸桿菌表達系統(tǒng)我國學者在大腸桿菌中表達了融合蛋白形式的鮭魚及人降鈣素，再從融合蛋白中切下羧基末端為甘氨酸的降鈣素前體，經肽酰甘氨酸?；瘑窝趺傅淖饔茫庸こ蔀槌墒斓慕碘}素。

大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前最常用的外源蛋白表達系統(tǒng)。它具有生長快速、生長周期短、培養(yǎng)條件簡單、安全性好、價格低廉、可以高效表達外源蛋白、適合不同的基因產物、易于進行工廠化批量生產等優(yōu)點，是人們克隆與表達外源基因的首選菌株。

然而這一方法也存在一定局限。用大腸桿菌表達降鈣素最大的問題是C-末端32位脯氨酰胺不能酰胺化，表達的降鈣素活性低，需要進行體外酰胺化提高活性，而且高效表達需不同異丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG）誘導，使得生產成本大大增加。另外，大腸桿菌表達的蛋白質多數(shù)是包涵體，包涵體變性后復性條件的優(yōu)化和復性效率也是一個難題。

乳酸桿菌表達系統(tǒng)乳酸桿菌是一種常見的益生菌，作為外源蛋白表達系統(tǒng)，它具有很多優(yōu)勢，如無致病性、在人和動物體內占絕對優(yōu)勢，使外源蛋白可能達到較高表達量等等。雖然有人對乳酸桿菌表達載體表達鮭魚降鈣素在實驗室中進行了嘗試，并獲得了成功，但目前對用乳酸桿菌表達降鈣素的研究很少。究其原因可能與以下幾個原因有關。

一是乳酸桿菌遺傳背景不清楚，它的質粒大多是隱蔽型的，因此對乳酸桿菌基因轉錄和翻譯的調控及蛋白質分泌的機制了解較少。二是直接飼喂重組的乳酸桿菌并不能在體內表達足夠的抗原量。三是長期低劑量的刺激可能導致機體免疫耐受。四是口服重組乳酸桿菌可能只對局部病變有較好的預防效果。乳酸桿菌也屬于原核表達系統(tǒng)，沒有真核翻譯后加工的功能，表達的降鈣素不能酰胺化，活性較低，必須進行后加工。

盡管如此，乳酸桿菌表達系統(tǒng)仍具有巨大的開發(fā)潛力。首先，乳酸桿菌像食物和水一樣可以直接口服，正是良好的口服疫苗載體。其次，乳酸桿菌不僅對機體無毒無害，而且它自身及其各種代謝產物對機體也有營養(yǎng)和免疫的功能，再加上其攜帶的目的蛋白的專一性作用，可以說是集多種功能于一身，正屬于現(xiàn)在最倡導的多功能微生態(tài)制劑。隨著基因工程技術的發(fā)展，乳酸桿菌的研究會日益清楚，重組乳酸桿菌基因工程菌的時代必將到來，并將在未來食品和醫(yī)藥工業(yè)領域得到更廣泛的應用。

酵母表達系統(tǒng)酵母是生產真核異源蛋白的宿主菌，既具有原核表達系統(tǒng)生長迅速、操作簡單、價格便宜、安全性好、遺傳背景清楚等優(yōu)點。目前用于表達降鈣素的主要是畢赤酵母。我國學者曾報道在畢赤酵母中表達了鮭魚降鈣素與骨生長肽(OGP)融合蛋白，細胞實驗(體外)和動物實驗(體內)結果都證明表達的融合蛋白既可以抑制破骨細胞的活性，又可以促進成骨細胞的活性。

雖然降鈣素在畢赤酵母中表達獲得了成功，但應該看到酵母表達系統(tǒng)仍存在局限性。首先，分泌表達產物存在不均一性，出現(xiàn)如信號肽加工不完全，表達產物在培養(yǎng)基中被自身分泌的蛋白酶降解等現(xiàn)象；其次，當利用該系統(tǒng)的載體將外源基因通過雙交換整合到宿主體中乙醇氧化酶1(AOX1)基因位置時，AOX1基因被破壞，這樣使細胞利用甲醇能力大大降低，從而大大延長了細胞培養(yǎng)發(fā)酵時間，長時間的發(fā)酵不利于外源蛋白的表達；第三，利用易燃的甲醇做原料，表達產物的衛(wèi)生安全性需要考慮；第四，篩選藥物價格昂貴也給生產應用帶來局限。重要的是畢赤酵母不能使蛋白酰胺化，故用酵母系統(tǒng)生產降鈣素活性不是很高，而且產品，不利于表達產物應用于人體。

昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)近年來，以昆蟲桿狀病毒作為表達載體已越來越受到人們的注意，用這種桿狀病毒為載體表達的外源基因已很多。其優(yōu)越性主要包括桿狀病毒對于脊椎動物和其他昆蟲細胞是安全的、在強有力的多角體蛋白啟動子轉錄控制下，外源基因表達的水平高等。

但是，也應該看到，昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)雖然以高表達著稱，然而不同外源基因產物的表達水平相差很大，實際表達水平可能受到很多因素的影響；傳統(tǒng)的昆蟲細胞內的重組方式步驟繁瑣、費時，獲得重組體的概率為0.1％～1.0％，且重組病毒的鑒定不易準確；桿狀病毒表達系統(tǒng)的外源蛋白只有少部分是分泌性的，而大部分是非分泌性的，不利于蛋白收集和分離；在病毒感染晚期，由于大量外源蛋白的表達，可引起宿主細胞的裂解，細胞裂解后，胞質內的物質釋放出來，使重組蛋白的純化很困難，水解酶的釋放可降解重組蛋白。

植物表達系統(tǒng)用植物表達系統(tǒng)生產降鈣素的主要方法是降鈣素在轉基因植物中的表達。這種植物生物反應器與其他生物反應器如細菌、酵母相比，優(yōu)點在于生產成本低、能準確地進行翻譯后加工，克服了原核表達系統(tǒng)不能完成蛋白翻譯后修飾的缺點、無病原污染等優(yōu)點。然而，由于外源基因DNA的甲基化、基因共抑制效應等原因，轉基因植物的表達效率不穩(wěn)定，影響了轉基因植物實現(xiàn)產業(yè)化。而且，這種方法中目標蛋白與植物內源蛋白難于分離，純化費用高。

值得一提的是，近年來出現(xiàn)了用植物油體表達體系生產降鈣素的方法。植物油體表達體系是將外源基因插入油體蛋白的N端或C端，構成融合蛋白，融合蛋白在轉基因植物種子中特異表達，并鑲嵌在油體表面。因此利用油體親脂疏水的特性，將轉基因植物種子經粉碎-液體抽提-離心處理，回收上層油相即可將融合蛋白與細胞內其它組分分開，可去除質量分數(shù)90％以上的種子蛋白。沈陽農業(yè)大學植物保護學院進行的建立油菜油體表達體系表達醫(yī)用蛋白鮭魚降鈣素的研究已通過成果鑒定。