《細(xì)胞和分子免疫學(xué)》 一、p56[SB]lck[/SB]

p56lck屬于以p60v-src/c-src為代表的蛋白酪氨酸激酶家族成員。同這個(gè)家族的其它成員一樣都具有酪氨酸激酶活性。目前發(fā)現(xiàn)，p56lck相對(duì)特異地存在于淋巴細(xì)胞中，尤其是成熟的靜止T淋巴細(xì)胞中。p56lck可能在T細(xì)胞活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及分化調(diào)節(jié)過(guò)程中起著重要的作用。

（一）p56lck結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)

1.p56lck的結(jié)構(gòu)　p56lck是由lck基因編碼的分子量為56kDa的單鏈分子，由509個(gè)氨基酸殘基組成。在小鼠，lck基因定位于4號(hào)染色體，人lck基因定位于1號(hào)染色體的1p32-35區(qū)間。同其它具有PTK活性的生長(zhǎng)因子受體如EGF-R和PDGF-R等比較，p56lck分了屬于非受體型蛋白酪氨酸激酶，無(wú)胞膜外區(qū)，其N-端通過(guò)豆蔻酸（myristic acid）與細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)面相連。p56lck分子結(jié)構(gòu)可以分為四個(gè)功能區(qū)：（1）膜接觸區(qū)，位于N-端，N-端第2位Gly能結(jié)合豆蔻酸，通過(guò)豆蔻酸與細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)面相連；（2）底物作用區(qū)，該區(qū)的氨基酸結(jié)構(gòu)不同于src家族的大部分其它成員；（3）催化區(qū)或激酶區(qū)，這一區(qū)域在氨基酸組成上與其它src家族成員高度同源；（4）調(diào)節(jié)區(qū)，位于羧基端，可能與p56lck的PTK活性的特異調(diào)節(jié)有關(guān)（圖8-6）。

圖8-6 p56lck分子的功能區(qū)

2.p56lck的功能特點(diǎn)　p56lck底物作用區(qū)存在幾個(gè)位置尚不明確的Ser磷酸化位點(diǎn)；催化區(qū)Lys273是ATP結(jié)合點(diǎn)，Tyr394為自身磷酸化位點(diǎn)；調(diào)節(jié)區(qū)Tyr505是調(diào)性磷酸化位點(diǎn)。在靜止細(xì)胞中，p56lck在Tyr505上發(fā)生磷酸化，但當(dāng)細(xì)胞活化時(shí)這個(gè)殘基則發(fā)生去磷酸化，隨之發(fā)生激酶的活化以及Tyr394的自身磷酸化。目前研究認(rèn)為，CD45通過(guò)使Tyr505去磷酸化對(duì)p56lck起正調(diào)控作用；而p50csk是使Tyr505發(fā)生磷酸化對(duì)p56lck則起負(fù)調(diào)控作用。CD45和p50csk對(duì)其它src家族PTKs也發(fā)揮著同樣的調(diào)節(jié)作用。

（二）p56lck與CD4/CD8分子

1.p56lck的分布　CD4和CD8以共受體形式（coreceptor）表達(dá)于成熟的T淋巴細(xì)胞，盡管CD4和CD8跨膜分子都屬于免疫球蛋白超家族，但它們之間僅存在有限的同源性。CD4和CD8分子分別與MHCⅡ類和MHc I類分子的恒定區(qū)決定簇相互作用。CD4是分子量為55-60kDa的糖蛋白，以單體形式表達(dá)。CD8是由二致辭體組成，有兩種形式：一種是由兩條α鏈（32-34kDa）組成的同源二聚體；另一種形式是由α鏈和β鏈（25-26kDa）組成的異源二聚體。CD4和CD8分子中胞漿內(nèi)部分子不具有激酶功能區(qū)，因此它們與受體酪氨酸激酶如EGF-R或PDGF-R無(wú)同源性。目前已經(jīng)證實(shí)CD4和CD8均與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成份p56lckPTK相連接。p56lck幾乎在所有淋巴細(xì)胞中表達(dá)，包括全部成熟T細(xì)胞和胸腺細(xì)胞，提示它可能在T細(xì)胞活化和分化調(diào)節(jié)過(guò)程中起作用。有關(guān)p56lck在T細(xì)胞活化信號(hào)中正調(diào)節(jié)作用的最初發(fā)現(xiàn)是p56lck直接同CD4或CD8復(fù)合受體分子胞漿內(nèi)功能域相連接，在體外具有酪氨酸激酶活性，在體內(nèi)，T細(xì)胞受到刺激后酪氨酸磷酸化水平增加。即使在靜止的鼠CD4-T細(xì)胞中也有大約50%細(xì)胞內(nèi)p56lck是同CD4糖蛋白相連接。

圖8-7　p56lck同CD4、CD8作用的模式圖

2.p56lck與CD4/CD8分子的連接　p56lck同CD4/CD8相互作用的區(qū)域位于分子的氨基端的底物作用區(qū)（圖8-7），此區(qū)域在src相關(guān)PTKs中是獨(dú)特的，含有4個(gè)半胱氨酸，這對(duì)于p56lck與CD4和CD8相互作用是必須的。底物作用區(qū)中6個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸可使p56lck與CD4/CD8結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)相對(duì)應(yīng)的堿性氨基酸殘基相結(jié)合。在CD4和CD8α分子的胞漿內(nèi)有一個(gè)含13個(gè)氨基酸的相似區(qū)域，經(jīng)突變研究和肽競(jìng)爭(zhēng)分析法證實(shí)此區(qū)域可能為p56lck結(jié)合區(qū)域。CD4和CD8α含有兩個(gè)對(duì)于p56lck結(jié)合起關(guān)鍵作用的半胱氨酸以及與p56lck氨基末端負(fù)電荷相互作用的5個(gè)帶正電荷的氨基酸。證實(shí)此區(qū)域中有6個(gè)氨基酸直接與p56lck結(jié)合有關(guān)，如果把這6個(gè)氨基酸殘基從CD8α胞漿功能域轉(zhuǎn)移到一個(gè)非相關(guān)蛋白水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）胞漿功能區(qū)域上，p56lck即可結(jié)合到這個(gè)雜交分子上去。

3.p56lck參與T細(xì)胞活化　用蛋白激酶C激活劑刺激T淋巴細(xì)胞可引起p56lck從CD4分子上解離下來(lái)，隨后發(fā)生CD4內(nèi)化。CD8分子在這方面不同于CD4，CD8+T淋巴細(xì)胞經(jīng)PKC激活劑刺激事對(duì)CD8分子內(nèi)化以及CD8-p56lck的解離影響極微?，F(xiàn)已提示，p56lck可能以生長(zhǎng)因子PTK受體相同方式起作用，即TCR結(jié)合與MHC相連的抗原后，CD4中CD8與MHC相互作用，與CD4或CD8相連接的p56lck補(bǔ)充到TCR多肽胞漿內(nèi)部分靠得很近的區(qū)域，然后發(fā)生PTK的活化以及TCR內(nèi)底物（？）和/或其鄰近分子（PLCγ1？）的磷酸化。p56lck除參與抗原誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞活化外，還可能參與T細(xì)胞的分化和成熟。在T細(xì)胞分化的所有階段，包括CD4、CD8雙陽(yáng)性胸腺細(xì)胞都可檢測(cè)到p56lck與CD4和CD8形成的復(fù)合物。

（三）p56lck與非CD4/CD8分子

p56lck除了同CD4和CD8形成復(fù)合體外，還可能同另外一些參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞受體分子形成穩(wěn)定的復(fù)合物。

1.p56lck與IL-2R的關(guān)系　IL-2R由α、β、γ三條肽鏈組成。三條肽的不同組合即αβγ，βγ以及單獨(dú)α分別構(gòu)成IL-2的高、中、低三種親和力的受體。由于IL-2Rα鏈在胞漿內(nèi)僅有一個(gè)較短的功能域（13個(gè)氨基酸殘基），所以介導(dǎo)IL-2R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要為β和γ鏈。IL-2Rβ鏈胞漿內(nèi)有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：其中一個(gè)靠近細(xì)胞膜，富含絲氨酸，對(duì)于IL-2誘導(dǎo)的增殖信號(hào)具有重要作用；另一結(jié)構(gòu)域遠(yuǎn)離細(xì)胞膜，富含酸性氨基酸，為酪氨酸激酶物理連接部位。經(jīng)IL-2Rβ鏈免疫沉淀后進(jìn)行免疫印跡也證實(shí)了IL-2Rβ鏈同p56lck相連。體外系統(tǒng)中也發(fā)現(xiàn)IL-2結(jié)合到IL-2R后可促進(jìn)p56lck活性，引起IL-2Rβ鏈的酪氨酸磷酸化。IL-2Rγ鏈胞漿內(nèi)含86個(gè)氨基酸，無(wú)激酶功能區(qū)，但具有一個(gè)與SH-2同源的區(qū)域，可能參與IL-2R介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。最近研究表明，IL-2Rγ鏈為IL-4、IL-7、IL-9、IL-13等細(xì)胞因子受體所共用（common chain,γC)。

2.p56lck與其它分子的關(guān)系　同p56lck相互作用的其它一組分子有人T細(xì)胞糖磷脂酰肌醇（glycophosphatidylinositol,GPI）連接的蛋白包括CD59、CD55、CD48以及小鼠T細(xì)胞中的Thy-1。應(yīng)用免疫沉淀方法均能使這些分子同p56lck發(fā)生共免疫沉淀。此外，將T淋巴細(xì)胞同針對(duì)GPI連接的膜分子特異性抗體孵育，然后加入二抗使其交聯(lián)，均發(fā)生幾種內(nèi)源性底物的酪氨酸磷酸化。

許多GPI連接的細(xì)胞表面分子可能以兩種不同的形式表達(dá)在T細(xì)胞中，這是由相應(yīng)分子mRNA不同拼接所致。一種形式是通過(guò)GPI附著在細(xì)胞膜上，另一種形式具有跨膜區(qū)和胞漿的PLC去掉所有GPI相連的膜蛋白后進(jìn)行免疫沉淀，并分析它們相連的激酶活性，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)酪氨酸磷酸化活性已喪失，表明GPI連接物對(duì)于同p56lck相結(jié)合是必需的。

采用烷基化試劑或金屬離子結(jié)合試劑進(jìn)一步證實(shí)了CD4/CD8多肽和GPI連接膜蛋白是分別通過(guò)兩種不同的機(jī)理與p56lck相互作用的。這些試劑可以干擾p56lck同CD4或CD8分子的相互作用，因?yàn)閜56lck同CD4或CD8的相互作用依賴游離半胱氨酸的存在，并需要金屬離子使之穩(wěn)定這種結(jié)合；而p56lck與GPI相連結(jié)的蛋白的結(jié)合則不受這些試劑影響。這些結(jié)果表明，p56lck通過(guò)兩種或更多不同相互作用機(jī)理，直接或間接地同多種細(xì)胞表面蛋白形成復(fù)合物。