《實驗動物科學(xué)》 二、傳出神經(jīng)藥理學(xué)實驗中的選擇與應(yīng)用

（一）一般實驗方法和動物的選擇

在測定新藥的急性毒性實驗（LD50）時，動物如出現(xiàn)豎毛，活動增加，激動興奮，以致發(fā)展為強直一陣攣性抽搐，可初步考慮為擬交感藥。進(jìn)而可觀察其動物（或貓）血壓的反應(yīng)，如興奮α-受體，則對血壓影響較大，并反射地使心率減慢，如興奮β受體，可見血壓下降和心率明顯增快。為了較確切地區(qū)分其對α、β受體的作用，還可采用α受體阻斷藥酚妥拉明，β受體阻斷藥心得安等作為工具。除血壓實驗外，尚可采用貓瞬膜，貓（或狗）在體腸活動等實驗方法。利用一些體外實驗可分析擬交感藥的作用部位，其中最敏感的實驗之一是大白鼠胃底條，此外有兔頭肌、離體兔耳、豚鼠氣管鏈、豚鼠回腸和雞盲腸等制備。可用已知的α或β-受體興奮劑作為標(biāo)準(zhǔn)，觀察它們與α或β-受體阻斷藥的相互作用，而確定其作用部位。

乙酰膽鹼具有毒蕈堿樣及菸堿樣作用，前者可被阿托品阻斷，后者可被神經(jīng)節(jié)阻滯藥及橫紋機松馳藥阻斷。凡是通過直接或間接作用興奮副交感效應(yīng)點的藥物可出現(xiàn)流淚、流涎、排尿和排便癥候群。因此在小白鼠LD50實驗中可獲得初步印象，進(jìn)而分別觀察其對血壓、唾液、瞳孔及胃腸道等反應(yīng)。在貓血壓實驗、蛙心、蛙腹直肌、水蛭背肌等標(biāo)本上可檢定擬膽堿藥和觀察抗膽堿藥的作用，亦可用整體實驗如抑制大白鼠胃潰瘍，抑制大白鼠腸內(nèi)活性炭下移等方法觀察之。

（二）心血管實驗

血壓實驗是檢驗傳出神經(jīng)藥物極其敏感的方法，一般采用急性血壓實驗，動物中以狗、貓、兔和大白鼠常用。兔不適用于降壓實驗，因其易于死亡。實驗可用麻醉或毀腦動物，因麻醉動物的血壓常有三級波動（第一級波動，又稱脈搏性波動，系每次心搏影響血壓所致，第二級波動，又稱呼吸性波動，即吸氣時，血壓微升，呼氣時血壓微降；第三級波動，系血管運動中樞以稍長間隔，興奮性周期性改變），使血壓升降不穩(wěn)。如動物毀腦后，可排除脊髓以上的中樞神經(jīng)神經(jīng)對血壓的影響，只出現(xiàn)第一級波動，血壓曲線極不平衡。

離體兔主動脈條實驗：兔主動脈上含有α-受體，它是測定作用于α-受體藥物的一個很好標(biāo)本，已被廣泛用來鑒定和分析擬交感藥及其對抗藥的作用。兔主動脈制備曾試制過多種形式，如主動脈環(huán)、片及條狀等，但兔主動脈螺旋條是最合適的方法之一。此標(biāo)本有較多優(yōu)點，如一個主動脈可制作3～4個標(biāo)本，可供配對試驗，對低濃度擬交感藥就很敏感，組織穩(wěn)定性好，可維持較長時間。

（三）消化道平滑肌實驗

多種動物的離體腸道可用來試驗傳出神經(jīng)藥物，一般多用離體豚鼠及兔的腸道。豚鼠回腸的自發(fā)活動較少，描記時有穩(wěn)定的基線，適合作藥物鑒定用。兔腸（尤其空腸）具有規(guī)則的擺動運動，適用于觀察藥物對此動物的影響。豚鼠回腸標(biāo)本加負(fù)荷后已完全松馳，因此加入擬交感藥不會使其更松馳。

離體豚鼠回腸可用于觀察乙酰膽堿（Ach）和擬膽堿藥的劑量－反應(yīng)關(guān)系；可檢定Ach和擬膽堿藥的含量。離體兔空腸有節(jié)律性收縮活動，可觀察腎上腺素（4μg）、去毒豆堿（2μg）等藥物對空腸擺動運動的影響。大白鼠胃底條是檢定兒茶酚胺類藥物和5-羥色胺（5-HT）最敏感的標(biāo)本。主要觀察藥物對胃縱行肌的作用，因標(biāo)本中環(huán)形肌已切斷。經(jīng)檢定兒茶酚胺對其敏感度要比大白鼠子宮標(biāo)本大10～100倍。雞食道由副交感神經(jīng)支配，因此離體雞食道標(biāo)本適合于試驗擬副交感藥物。由于其作用不能完全被神經(jīng)節(jié)阻斷藥所阻滯，故不宜用于試驗作用于神經(jīng)節(jié)的藥物。

（四）其它平滑肌等實驗

大白鼠子宮中腎上腺素能受體主要是β-受體，最適用于試驗β興奮劑和β-阻斷劑。它對異丙腎上腺素最敏感，腎上腺次之，對去甲腎上腺素極不敏感，因此亦可用來檢定含腎上腺素與去甲腎上腺素的混合液中前者的含量。

虹膜括約肌受副交感神經(jīng)支配，當(dāng)此神經(jīng)興奮或應(yīng)用擬膽堿藥時，瞳孔縮小，抗膽堿藥使瞳孔散大，虹膜輻射肌受交感神經(jīng)支配，此神經(jīng)興奮或應(yīng)用擬交感藥后使瞳孔散大。因此可利用動物的瞳孔來測試某藥系擬膽堿藥、抗膽堿藥或擬交感藥。常選用兔和貓的瞳孔進(jìn)行試驗。貓瞳孔對藥物反應(yīng)較靈敏。不麻醉狗的瞳孔不穩(wěn)定，擬交感藥對其作用極短暫。

離體貓脾條對兒茶酚胺類很敏感，適用于檢測擬交感藥和α-阻滯藥。脾條對擬交感藥的反應(yīng)較慢，開始迅速收縮后，即慢慢上升，3～5分鐘收縮達(dá)高峰，恢復(fù)亦慢，即使接觸低濃度的擬交感藥，亦需5分鐘恢復(fù)，如用引起最大反應(yīng)的濃度時，常需2小時才恢復(fù)。此標(biāo)本對異丙腎上腺素不敏感，一般濃度達(dá)2×10-5M才出現(xiàn)反應(yīng)，5×10-2M達(dá)最大反應(yīng)。

水蛭的背肌和蛙復(fù)直肌一樣，Ach使之收縮，用毒扁豆毒堿處理后，對Ach敏感性大增，此時Ach的劑量即使低到10-5M或以下，亦能使懸于5ml浴槽中的肌肉收縮，因此適用于測試微量的未知擬膽堿藥。亦適于測定刺激神經(jīng)（如貓頸上神經(jīng)）后釋放的Ach量。

蛙復(fù)直肌標(biāo)本可用來檢測阻斷神經(jīng)肌接點的藥物反應(yīng)和檢定Ach和擬膽堿藥，方法簡便易行，結(jié)果較正確。但在檢定Ach時，在有毒扁豆堿存在的條件下，其敏感性不及豚鼠回腸和水蛭背肌。

（五）影響傳出神經(jīng)遞質(zhì)的藥物實驗

1．貓瞬膜：貓的瞬膜形大且反應(yīng)靈敏，因此是進(jìn)行瞬膜實驗首選和最適合的動物。狗和兔雖然也有瞬膜，但形小，用藥后變化較小，且兔的瞬膜反應(yīng)性有不同，故后兩種動物一般不采用。瞬膜由頸上神經(jīng)節(jié)后纖維支配，屬腎上腺素能神經(jīng)，瞬膜內(nèi)存有α-受體。貓的瞬膜標(biāo)本在鑒別神經(jīng)節(jié)阻滯藥和α-受體阻滯藥研究中也是常用的方法之一。如受試藥物是神經(jīng)節(jié)阻滯藥，則刺激節(jié)前纖維和注入酰膽堿均無瞬膜反應(yīng)，而刺激節(jié)后維或注入去甲腎上腺素仍有瞬膜反應(yīng)。若受試藥物是影響遞質(zhì)的，則刺激節(jié)前纖維、節(jié)后纖維或給乙酰膽堿均無瞬膜反應(yīng)，給去甲腎上腺素瞬膜反應(yīng)仍存在，甚至增強其反應(yīng)，以資鑒別這兩類藥物。

2．兔腸系膜神經(jīng)：離體兔腸系膜神經(jīng)一回腸實驗常選用兔的回腸制備較為合適，因為兔腸的擺動動物（鐘擺運動）波輻射較大。豚鼠的腸制備也可用，但擺動波輻小，用藥后抑制反應(yīng)不易看出。貓、狗等腸壁厚，對兒茶酚胺類藥物和其它藥物反應(yīng)遲鈍，故不選用。刺激腸系膜神經(jīng)（系腎上腺系能神經(jīng)）可抑制回腸的擺動運動。如受試藥物能阻斷這一抑制反應(yīng)，而不影響甚至增強去甲腎上腺素或腎上腺素對回腸擺動運動的抑制作用，則可推斷該藥是腎上腺素能神經(jīng)阻斷滯藥。

3．兔耳：兔耳灌流法是篩選腎上腺素能神經(jīng)阻滯藥和α-受體阻滯藥常用的方法之一。前一類藥物能抑制耳大神經(jīng)刺激引起的血管收縮反應(yīng)，使灌流量增加，但去甲可腎上腺素或腎上腺素引起的血管收縮反應(yīng)反而增強，使其灌流量減少。根據(jù)上述作用，可以鑒別這兩類藥物。根據(jù)1960年Hukoric在離體兔耳灌流研究中認(rèn)為耳大神經(jīng)除含有腎上腺素能神經(jīng)外，還有少部分膽堿能神經(jīng)。用腎上腺素能神經(jīng)阻滯藥后膽堿能神經(jīng)的作用表現(xiàn)得更充分，因此，在實驗設(shè)計中，用阿托品8μg阻斷其毒蕈堿樣作用，使其不干擾腎上腺素能神經(jīng)阻滯藥物研究。

4．貓脾神經(jīng)：脾神經(jīng)-脾標(biāo)本制備在腎上腺素能神經(jīng)阻滯藥或α-受體阻滯藥的研究中是常用的方法之一。前一類藥使用后，刺激神經(jīng)，使脾靜脈血中去甲腎上腺素含量降低；后一類藥使用后，則使去甲腎上腺素含量增加，以此來鑒別兩類藥物。常選用貓來作此實驗。

5．豚鼠下腹神經(jīng)－輸精管：下腹神經(jīng)是交感神經(jīng)節(jié)后纖維，支配輸精管或子宮。該實驗在研究腎上腺素能神經(jīng)阻滯藥和α受體阻滯藥中是常用的方法之一。受試藥物能阻滯刺激下腹神經(jīng)引起的輸精管或子宮收縮作用，卻不能影響去甲腎上腺素或腎上腺素的反應(yīng)，甚至可增強其作用，則可確定該藥為腎上腺素能神經(jīng)阻滯藥。豚鼠的輸精管對交感胺的收縮反應(yīng)較子宮迅速，洗去后恢復(fù)也較快，因此常選用豚鼠作此標(biāo)本進(jìn)行試驗。

6．兔交感神經(jīng)－心房：離體兔交感神經(jīng)－心房標(biāo)本主要用于觀察腎上腺素能神經(jīng)阻滯藥的作用。刺激交感神經(jīng)，引起心率加速，收縮力加強。這類藥使用后，阻斷上述反應(yīng)，但不能對抗去甲腎上腺素或腎上腺素對心臟的興奮作用。此標(biāo)本制備除主要選用兔外，小貓（1～2Kg重）、豚鼠也可采用。

7．大白鼠血壓：R.Lesic等在大白鼠血壓實驗中發(fā)現(xiàn)毒扁豆堿能引起升壓反應(yīng)，而在狗、貓、鼠等實驗動物中，該藥主要引起降壓反應(yīng)。利血平能阻斷大白鼠對毒主扁豆堿的升壓作用。切除兩側(cè)腎上腺，不影響其升壓反應(yīng)，便橫斷脊柱，其升壓反應(yīng)立即消失。因此，他們認(rèn)為大白鼠對毒扁豆堿的升壓反應(yīng)可能是中樞性的，再通過外周交感神經(jīng)表現(xiàn)出來。毒扁豆堿引起的大白鼠升壓反應(yīng)的實驗?zāi)Ｐ涂捎脕硌芯坑绊懩I上腺素能神經(jīng)遞質(zhì)釋放的藥物。如某藥物使用后，再注射毒扁豆堿，其升壓作用消失，便去甲腎上腺素或腎上腺素的升壓作用仍不變，甚至增強，則可能提示該藥為腎上腺素能神經(jīng)阻滯藥。

（六）作用于膽堿受體和腎上腺素受體的藥物實驗

膽堿受體有M和N兩種，當(dāng)M受體興奮時，表現(xiàn)為心率減慢，心收縮力減弱，血壓下降，胃腸道平滑肌收縮，瞳孔縮小，唾液分泌增加，支氣管平滑肌收縮等，已知典型的M受體阻滯藥阿托品等能阻滯上述作用。欲確定一個未知藥是否作用于M膽堿受體，其作用性質(zhì)是興奮、抑制或阻斷，可選離體豚鼠回腸、兔的瞳孔、兔的唾液腺分泌、大鼠或貓的血壓、離體蛙心和離體兔右心房等實驗，與已知藥匹魯卡品或阿托品對照，即可獲得明確結(jié)論。N-膽堿受體分為N1和N2兩種。N1膽堿受體興奮時，植物神經(jīng)節(jié)興奮及腎上腺髓質(zhì)分泌。在阿托品化貓，凡不具有血管收縮作用而能使血壓升高的藥物，初步可認(rèn)為其作用部位在N1膽堿受體。N2膽堿受體興奮時骨骼肌收縮，可采用水蛭背肌或蛙腹直肌標(biāo)本實驗，即能得到結(jié)果。

二苯羥乙酸奎寧酯（Quinuclidiny1Benzilate,QNB）是一個M-受體阻滯藥，它能與M-膽堿受體緊密結(jié)合，維持時間較長，為研究M-膽堿受體提供了一個有效的工具。節(jié)后擬膽堿藥或節(jié)后抗膽堿藥都能與M-膽堿受體結(jié)合，因此均可降低3H-QNB的結(jié)合率。常選用豚鼠的回腸作此實驗。此外，還可選用豚鼠的心臟、肺臟、腦及脾臟，這些組織勻漿均具有與3H-QNB結(jié)合的M-膽堿受體。但在肝臟、腎臟及隔肌則不存在與3H-QNB結(jié)合的M受體。

腎上腺素受體有α和β兩種，當(dāng)α受體興奮時，表現(xiàn)為皮膚、粘膜及內(nèi)臟壓管收縮，胃腸道平滑肌松弛，瞳孔散大，瞬膜收縮，子宮收縮等。已知典型的α受體阻滯藥酚妥拉明和妥拉蘇林等能阻斷上述作用。常選用離體兔主動脈條、離體豚鼠或大鼠輸精管、離體貓脾條、離體大白鼠胃底條、離體兔空腸等作α受體作用實驗。β受體興奮時，表現(xiàn)為心率加快，心收縮力加強，傳導(dǎo)加速，骨骼肌血管和冠狀動脈擴張，胃腸道平滑機松弛，支氣管擴張，糖原和脂肪分解等。由于β受體又分β1、β2兩種，對于這兩種亞型受體作用的觀察，一般是以心臟效應(yīng)作為觀察β1受體作用，而以氣管、支氣管效應(yīng)作為觀察β2受體作用。已知典型的β受體阻滯藥心得安等能阻斷上述作用。常選用離體蛙心、離體原位蛙心排出量、兔心灌注、在位貓（或兔）心實驗、兔（豚鼠）離體心房實驗、離體大白鼠子宮、離體豚鼠氣管片等作β受體作用實驗。

未妊娠兔的離體子宮對α受體興奮藥十分敏感，可使之強烈收縮，故可用于鑒定α受體興奮藥或阻滯藥。脂肪組織存在β受體，凡能興奮β受體的藥物均能引起游離脂肪酸的釋放增加。如預(yù)先加入β受體阻滯藥，則可使游離脂肪酸的釋放量明顯減少，甚至完全阻斷，故此法亦用來鑒定作用于β受體的藥物。常選用不饑餓的雄性大白鼠，麻醉下取其副睪脂肪墊作實驗。子宮平滑肌收縮為α受體興奮反應(yīng)，目前常選用兔子宮平滑肌膜與3H-DHE（即3H-Dihydrocryptne,是一個α受體阻滯藥）進(jìn)行體外培養(yǎng)，3H-DHE與子宮平滑肌膜上α受體結(jié)合，25℃不超過17分鐘，即能完全達(dá)到結(jié)合，而且結(jié)合穩(wěn)定性較好，至少可維持39分鐘，常用來鑒定α受體。

（七）骨骼肌松弛藥實驗

在進(jìn)行神經(jīng)肌接點阻斷藥試驗研究時，動物品種的選擇是十分重要的，因神經(jīng)肌接點阻斷藥的效應(yīng)有明顯的動物種屬差異，只有選用在反應(yīng)性質(zhì)和程度與人相似的動物進(jìn)行實驗，所得結(jié)果才對臨床用藥有較高的參考價值。

不同種動物對同一種神經(jīng)肌接點阻滯藥的反應(yīng)不同，如貓、狗、兔、大白鼠對十烴季銨和筒箭毒的敏感性各不相同，其間差異見圖10-8、表10-30所示。不同種屬動物對神經(jīng)肌接點阻斷藥反應(yīng)的差異不僅表現(xiàn)在作用強度上，而且反應(yīng)在作用性質(zhì)上，如貓對琥珀酰膽堿、十烴季銨的反應(yīng)與人近似，呈單純?nèi)O化型阻斷作用，而在兔、豚鼠、大白鼠常表現(xiàn)為雙相阻斷作用。雞對十烴季鋟特別敏感，大白鼠對筒箭毒敏感，人對十烴季銨與筒箭毒的反應(yīng)介于貓對狗之間而與貓近似。雖然蛙、兔、小雞、小白鼠等動物在神經(jīng)肌接點阻斷藥的試驗研究上各有應(yīng)用價值，如蛙可在不用人工呼吸的條件下作用于觀察神經(jīng)肌接點阻斷藥的作用，小雞可用于區(qū)別去極化型阻斷藥與非去極化型阻斷藥，兔垂頭法可用于觀察神經(jīng)肌接點阻斷藥的效應(yīng)和鑒定其效價，小白鼠用于神經(jīng)肌接點阻斷藥的初篩，但以貓對神經(jīng)肌接點阻斷藥的的反應(yīng)與人最近似，故貓是必不可少的試驗動物，但也不是一切試驗均需要在貓身上進(jìn)行。

圖10-3不同種實驗動物對十烴季銨和筒箭毒的敏感性

表10-30　一些神經(jīng)肌接點阻斷藥對人、貓、大白鼠的相對效價*

動　物人貓大　白　鼠氯化筒箭毒1/(10mg)1/(0.4mg/kg)1/(0.07mg/kg)三乙基碘化格拉明0.2/(50mg)0.26/(1.5mg/kg)0.02/(3.5　mg/kg)甲基硫酸勞德克辛0.5/(20mg)0.7/(0.6mg/kg)0.04/(2　mg/kg)氯化苯唑醌銨1/(10mg)1.6/(0.25mg/kg)0.07/1　mg/kg)碘化十烴季銨4.5/(2.24mg)10/(0.04mg/kg)0.04/2　mg/kg)氯化琥珀酰膽鹼1/(10mg)8/(0.05mg/kg)0.07/1　mg/kg)溴化氨酰膽鹼4.5/(2.24mg)20/(0.02mg/kg)0.05/1.5　mg/kg)

*每格中上面數(shù)字是以筒箭毒用為1m算出的相對強度。插號中數(shù)字為產(chǎn)生90-95%神經(jīng)肌接點阻斷作用所需劑量。