麝香保心丸促進(jìn)治療性血管新生實(shí)驗(yàn)研究

血管新生在冠心病、缺血性腦栓塞、骨折創(chuàng)傷、腫瘤及白內(nèi)障等的治療、恢復(fù)和預(yù)后中具有重要意義。中醫(yī)治療缺血性疾病有著悠久的歷史,并取得了顯著的成效。麝香保心丸是中藥治療冠心病最具影響力的代表藥之一,經(jīng)多年的臨床實(shí)踐證明,有顯著的抗心肌缺血作用。藥理研究發(fā)現(xiàn),麝香保心丸具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈1、保護(hù)血管內(nèi)皮、抑制動(dòng)脈粥樣硬化2以及減小心梗面積、預(yù)防心室重構(gòu)等作用3。近年還使用不同方法對(duì)麝香保心丸進(jìn)行系列研究,從分子水平、組織水平和解剖水平證實(shí)了它在體外和動(dòng)物模型中的促血管新生作用。

血管生長(zhǎng)因子的含量和表達(dá)

血管生長(zhǎng)因子是調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)的重要因素。目前,眾多血管生長(zhǎng)因子的研究結(jié)果顯示,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)是最重要的生長(zhǎng)因子,并已被用于促進(jìn)血管新生的治療4,5。

汪珊珊等6在對(duì)培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn),麝香保心丸可促進(jìn)VEGF和bFGF的mRNA表達(dá),增加在培養(yǎng)上清液中的含量,這與生理鹽水組有顯著差異(P<0.01)。同樣,在對(duì)心肌梗死動(dòng)物模型中,顯微鏡下可見(jiàn)麝香保心丸組VEGF和bFGF的陽(yáng)性染色區(qū)域彌散分布于心肌細(xì)胞與間質(zhì)中,染色程度與作為陽(yáng)性對(duì)照的重組人堿性成評(píng)估細(xì)胞生長(zhǎng)因子與肝素組無(wú)顯著差異,而生理鹽水組各因子的陽(yáng)性染色面積較小(P<0.01),說(shuō)明麝香保心丸可促進(jìn)缺血心肌血管生長(zhǎng)因子的表達(dá)(圖1)。

內(nèi)皮細(xì)胞增殖及管腔結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)

血管新生是從血管內(nèi)皮細(xì)胞受到刺激而增殖游走開(kāi)始的。微血管在受到相關(guān)刺激后,血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變,細(xì)胞周期縮短。同時(shí),內(nèi)皮細(xì)胞開(kāi)始增殖,在趨化因子和粘附分子的作用下出現(xiàn)游走及粘附,與周細(xì)胞合成新的基底膜并形成管腔,從而組成新毛細(xì)血管的基本結(jié)構(gòu)。對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及管腔結(jié)構(gòu)形成的評(píng)價(jià),也是藥物促進(jìn)血管新生的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)7。

在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)中6使用了牛腎上腺微血管內(nèi)皮細(xì)胞。麝香保心丸可促進(jìn)培養(yǎng)的牛腎上腺微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,表現(xiàn)出有一定的濃度依賴(lài)性趨勢(shì),其大劑量組(40ml,即2g/L)的細(xì)胞數(shù)多于小劑量組(20ml,即1g/L),大劑量組和小劑量組的細(xì)胞數(shù)均明顯多于生理鹽水對(duì)照組(P<0.01)。顯微鏡下麝香保心丸組可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞排列成管腔結(jié)構(gòu)明顯增多(圖2)。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后,各組的管腔結(jié)構(gòu)數(shù)見(jiàn)表1。麝香保心丸促進(jìn)培養(yǎng)的牛腎上腺微血管內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔結(jié)構(gòu),也表現(xiàn)出一定的濃度依賴(lài)性趨勢(shì)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,麝香保心丸可能通過(guò)促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖并形成管腔結(jié)構(gòu)來(lái)促進(jìn)新生血管的形成。

雞胚絨毛尿囊膜模型

雞胚絨毛尿囊膜模型(CAM)是體外研究血管新生和抗血管新生最常用的方法之一。孵育過(guò)程中的受精雞蛋暴露于絨毛尿囊膜,在促血管新生藥物刺激72~96個(gè)小時(shí)后,受藥物刺激的實(shí)驗(yàn)部位周?chē)奢椛錉钌L(zhǎng)出新生血管。以實(shí)驗(yàn)部位邊緣1mm范圍內(nèi)為一級(jí)血管,實(shí)驗(yàn)部位邊緣5mm處為二級(jí)血管,對(duì)新生血管進(jìn)行計(jì)數(shù)比較可用于促血管新生藥物的評(píng)價(jià)和篩選8,9。

CAM研究結(jié)果顯示6,濃度為50g/L的麝香保心丸10ml,可使CAM血管數(shù)比生理鹽水組明顯增加,血管分支增多,但較bFGF組要少。計(jì)數(shù)各處理組的一、二級(jí)血管數(shù),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果說(shuō)明麝香保心丸可促進(jìn)血管新生(圖3)。

心肌梗死模型新生血管密度

在體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了麝香保心丸的促血管新生作用后,王大英等10采用大鼠心肌梗死模型來(lái)評(píng)價(jià)麝香保心丸在活體動(dòng)物模型中的作用。大鼠用鹽酸氯胺酮(80mg/kg)腹腔麻醉后,用呼吸機(jī)輔助呼吸,在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳交界稍下1~2mm處用無(wú)創(chuàng)縫線結(jié)扎左側(cè)冠狀動(dòng)脈,開(kāi)胸前后即時(shí)記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖,以結(jié)扎部位下心肌變白、搏動(dòng)減弱且心電圖出現(xiàn)ST段弓背向上明顯抬高為造模成功。在心梗造模后每天用麝香保心丸15mg/kg或生理鹽水灌胃2次,6周后處死動(dòng)物,并留心臟標(biāo)本。

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,麝香保心丸組可見(jiàn)較多微小血管均勻地分布在梗死邊緣區(qū)心肌組織,其促血管新生作用與陽(yáng)性對(duì)照貝復(fù)劑肝素組相當(dāng),無(wú)顯著差異(P>0.05),血管面密度比假手術(shù)組和正常組高,而生理鹽水組僅見(jiàn)梗死邊緣區(qū)稀疏散在的微小血管,組間有顯著差異(P<0.01)。這一結(jié)果說(shuō)明麝香保心丸可促進(jìn)心梗后的代償性血管新生,并且血管新生的程度與劑量相關(guān)。手術(shù)本身對(duì)結(jié)果影響不大,因此排除了手術(shù)對(duì)血管新生的影響(圖4)。

韓麗華等11在建立大鼠心梗模型后,使用益氣活血方劑、麝香保心丸、生理鹽水灌胃6周后處死動(dòng)物,取心肌組織用免疫組化法(CD34)測(cè)定心梗邊緣區(qū)新生血管數(shù)及微血管密度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)麝香保心丸組對(duì)新生血管數(shù)及微血管密度的促進(jìn)作用最強(qiáng)(P<0.05),對(duì)缺血心肌具有保護(hù)作用。

小 結(jié)

一系列研究結(jié)果表明,麝香保心丸具有較明顯的促血管生成活性,其機(jī)制可能與其能使內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VEGF和bFGF mRNA增高并使VEGF和bFGF釋放增多有關(guān)。麝香保心丸在體外可促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖并形成管腔結(jié)構(gòu),以及能促進(jìn)CAM的血管生成。動(dòng)物模型的體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果顯示,麝香保心丸可促進(jìn)心肌缺血部位的血管新生。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果是對(duì)以往麝香保心丸藥理研究成果的重要補(bǔ)充,為其用于冠心病的治療提供了有利依據(jù)。血管生成治療對(duì)冠心病等缺血性疾病患者具有積極作用,而尋求促血管生成藥物和方法尤其是尋找適合外周給藥的有效藥物,無(wú)疑具有重要的意義。

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表1各組管腔結(jié)構(gòu)數(shù)目

組別 樣本數(shù) 管腔結(jié)構(gòu)數(shù)(個(gè)/HP,×100)

麝香保心丸小劑量86.2±0.6*

麝香保心丸大劑量87.6±0.8**

生理鹽水83.3±0.4

注:與生理鹽水組比較:* P<0.05,** P<0.01

李勇,現(xiàn)任復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院內(nèi)科學(xué)教授,華山醫(yī)院內(nèi)科學(xué)(心血管病學(xué))主任醫(yī)師,華山醫(yī)院心臟科副主任,心血管研究室主任,衛(wèi)生部心血管疾病防治研究中心專(zhuān)家委員會(huì)委員,中華醫(yī)學(xué)會(huì)上海心血管委員會(huì)委員。

主要從事高血壓、冠心病和心力衰竭及中西醫(yī)結(jié)合的臨床診治和科研工作,參加國(guó)際多中心臨床試驗(yàn)5項(xiàng),承擔(dān)國(guó)家十五攻關(guān)項(xiàng)目、衛(wèi)生部科研課題等,發(fā)表學(xué)術(shù)論文70余篇。