上海中醫(yī)藥大學(xué)發(fā)現(xiàn)兩古方抑制肝硬化作用機(jī)制

日前，上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所、上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院、上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心科研人員，在國家自然科學(xué)基金重大研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目、上海市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目的資助下，通過實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)了古方下瘀血湯和一貫煎抑制CCl4大鼠肝硬化形成的不同作用機(jī)制。

肝纖維化、肝硬化是一難治性病變，目前西醫(yī)學(xué)仍無有效的對(duì)策，而傳統(tǒng)中醫(yī)藥卻顯示出明顯的治療優(yōu)勢。基于中醫(yī)臨床實(shí)踐對(duì)肝炎后肝硬化基本證候病機(jī)“血瘀阻絡(luò)、氣陰兩虛、濕熱內(nèi)蘊(yùn)”的共識(shí)，針對(duì)基本證候病機(jī)，科研人員選擇了具有代表性的經(jīng)典方劑：清熱利濕茵陳蒿湯、化瘀下瘀血湯、益氣黃芪湯、養(yǎng)陰一貫煎（并以小柴胡湯為對(duì)照），對(duì)4種經(jīng)典肝硬化大鼠模型(四氯化碳、二甲基亞硝胺、膽管阻塞及豬血清免疫)進(jìn)行干預(yù)治療的橫向比較及二甲基亞硝胺肝硬化不同病理階段治療的縱向比較；依據(jù)各方劑干預(yù)不同病態(tài)模型或不同病理階段的藥效學(xué)判定結(jié)果，進(jìn)行作用機(jī)制的深入研究。探索基于中醫(yī)證候病機(jī)的多種不同功效方劑治療同一疾病獲效的現(xiàn)代科學(xué)基礎(chǔ)及病證結(jié)合研究的新途徑。目前，他們?cè)谒穆然迹–Cl4）大鼠肝硬化的研究中獲得進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)基于活血祛瘀的下瘀血湯、養(yǎng)陰的一貫煎可顯著抑制CCl4大鼠肝硬化的形成與發(fā)展，科研人員進(jìn)一步從促進(jìn)增生纖維結(jié)締組織的降解及保護(hù)肝細(xì)胞、抑制肝細(xì)胞凋亡等不同的角度，探討下瘀血湯、一貫煎抑制成型期大鼠肝硬化的祛邪與扶正的作用機(jī)制，為祛瘀與養(yǎng)陰治法干預(yù)大鼠肝硬化形成提供了科學(xué)證據(jù)。

研究人員以CCl43毫升·千克-1皮下注射，再用50%CCl4橄欖油溶液2毫升·千克-1皮下注射，每周兩次，第9周開始隨機(jī)分為模型對(duì)照組、下瘀血湯組及一貫煎組，藥物干預(yù)的同時(shí)繼續(xù)CCl4造模至12周末取材。檢測指標(biāo)包括肝組織病理學(xué)，肝組織Hyp含量，肝組織α-SMA、CD68、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2蛋白表達(dá)，MMP-2、MMP-9的活性，肝細(xì)胞凋亡指數(shù)及Cas鄄pase12、HGFα蛋白表達(dá)。

與正常大鼠比較，模型大鼠8周時(shí)α-SMA、CD68、TIMP-1蛋白表達(dá)顯著增加（P﹤0.01），12周時(shí)顯著高于8周模型對(duì)照組（P﹤0.01）；MMP-13、HGFα、TIMP-2蛋白表達(dá)逐漸降低，各時(shí)間點(diǎn)相互比較具有顯著性差異（P﹤0.01）；MMP-2，9活性4周時(shí)顯著升高（P﹤0.01），8周時(shí)較4周略有升高，12周時(shí)顯著高于8周模型對(duì)照組（P﹤0.01）；肝細(xì)胞凋亡指數(shù)、Capase12蛋白表達(dá)量逐漸增加，且各時(shí)間點(diǎn)比較均具有顯著性差異（P﹤0.05或0.01）。與同期模型對(duì)照組比較，干預(yù)組MMP-9活性及MMP-13、TIMP-2、HGFα蛋白表達(dá)量均顯著增加（P﹤0.01），其中下瘀血湯組MMP-9、MMP-13顯著高于一貫煎組（P﹤0.01），一貫煎組TIMP-2、HGFα顯著高于下瘀血湯組（P﹤0.01）；干預(yù)組MMP-2活性、TIMP-1蛋白表達(dá)顯著降低(P﹤0.01)，且一貫煎組顯著低于下瘀血湯組（P﹤0.01）；一貫煎組肝細(xì)胞凋亡指數(shù)、Capase12蛋白表達(dá)量顯著減少（P﹤0.01）。

研究人員發(fā)現(xiàn)，在肝硬化形成期（9~12周）予以下瘀血湯和一貫煎干預(yù)治療后，MMP-13蛋白表達(dá)量較同期模型組分別增加了548.25倍、82倍；MMP-9活性/T-IMP-1比值分別增加了1.21倍、0.91倍，下血湯組優(yōu)于一貫煎組。這種提高基質(zhì)金屬蛋白酶分泌量及其活性的作用可能與刺激枯否細(xì)胞（KC）活化有關(guān)。而KC可通過表達(dá)MMP-13而逆轉(zhuǎn)肝纖維化已得到證實(shí)。此次研究顯示，CD68蛋白表達(dá)8周時(shí)開始升高，12周時(shí)較8周增加了29.6%，而下瘀血湯和一貫煎干預(yù)治療后較同期模型對(duì)照組分別增加了21.8%、22.2%，表明KC在肝硬化的發(fā)生、發(fā)展和恢復(fù)過程中可能發(fā)揮著“雙刃劍”樣作用。而下瘀血湯和一貫煎可能具有“改邪歸正”的作用，即通過誘導(dǎo)KC活化并表達(dá)MMP-9、13，進(jìn)而促進(jìn)間質(zhì)性膠原的降解可能是兩首方劑尤其是下瘀血湯抑制肝硬化形成的重要途徑。結(jié)合下瘀血湯突出的降低肝組織Hyp含量的作用，表明下瘀血湯的“祛瘀”作用機(jī)制可能與提高膠原酶活性進(jìn)而降解過度沉積的細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)。

Caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路的關(guān)鍵酶，各種損傷都會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)Caspase-12表達(dá)。研究人員指出，從CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟蛋白質(zhì)組差異表達(dá)研究顯示，造模12周后模型大鼠有Caspase-12蛋白表達(dá)。一貫煎組肝細(xì)胞凋亡指數(shù)、Caspase-12蛋白表達(dá)分別較同期模型組降低了51.0％和50.8％，而下瘀血湯組無顯著改善，結(jié)合一貫煎可顯著提高模型大鼠血清Alb含量的特點(diǎn)，表明抑制肝細(xì)胞凋亡可能是一貫煎抑制肝硬化形成的重要機(jī)制之一，且這一機(jī)制與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路有關(guān)。此外，下瘀血湯和一貫煎干預(yù)治療后，α-SMA蛋白表達(dá)量分別下降了21.6%、51.8%，同時(shí)MMP-2活性/TIMP-2比值分別降低了22.4％、43.5％，TIMP-1蛋白表達(dá)量分別下降了28.3％、39.7％，且一貫煎均顯著優(yōu)于下瘀血湯。提示通過抑制HSCs的活化可能是一貫煎抑制肝硬化形成的又一重要途徑。下瘀血湯和一貫煎干預(yù)治療后肝組織HGFα較12周模型對(duì)照組分別增加了35.8％、40.0％，提示通過提高肝組織HGFα的蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肝細(xì)胞的有絲分裂、激發(fā)肝臟膠原酶的活性和促進(jìn)活化的肝星狀細(xì)胞凋亡，可能是一貫煎和下瘀血湯抑制肝硬化形成的共同作用途徑之一。

負(fù)責(zé)此項(xiàng)研究的上海中醫(yī)藥大學(xué)副校長劉平指出，中醫(yī)方劑是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下針對(duì)證候病機(jī)的中藥組合配伍形式，是一復(fù)雜系統(tǒng)，也是研究中醫(yī)理論復(fù)雜體系的主要載體。立足于中醫(yī)臨床實(shí)踐對(duì)肝炎后肝硬化基本證候病機(jī)的共識(shí)，針對(duì)證候病機(jī)，進(jìn)行不同功效古典方劑的比較對(duì)照研究，不僅能夠部分揭示下瘀血湯和一貫煎抑制肝硬化形成的不同作用機(jī)制，顯示出中醫(yī)藥“同病異治”理論的科學(xué)內(nèi)涵；同時(shí)也為“祛邪與扶正”治法理論獲得部分生物學(xué)作用基礎(chǔ)的詮釋。劉平總結(jié)認(rèn)為，下瘀血湯的祛瘀作用主要表現(xiàn)為提高肝組織膠原降解活性，促進(jìn)異常沉積的纖維結(jié)締組織的降解；而一貫煎的“養(yǎng)陰扶正”作用主要在于抑制肝細(xì)胞凋亡和HSC的活化，保護(hù)患病機(jī)體的“正氣”。