摸索新途徑提高靶向性——脂質(zhì)體與配體偶聯(lián)方法一覽

脂質(zhì)體最早是在1965年被英國學者Bangham等作為研究生物膜的模型提出的。它是由脂質(zhì)雙分子層組成，內(nèi)部為水相的閉合囊泡。脂質(zhì)體的大小從幾十納米到幾十微米，在脂質(zhì)體的水相和膜內(nèi)可以包裹多種物質(zhì)。脂質(zhì)體一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，就引起了生物學家、藥學家的興趣。人們開始應(yīng)用脂質(zhì)體作為藥物的載體控制藥物的釋放，提高藥物靶向性，以減少藥物的毒副作用，提高藥物療效。目前，脂質(zhì)體的研究主要集中在四個領(lǐng)域：模擬膜的研究；藥物的可控釋放和體內(nèi)的靶向給藥；皮膚及化妝品等日用工業(yè)品的基質(zhì)；基因及其他生理活性物質(zhì)向細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運。

脂質(zhì)體的靶向性分為主動靶向、被動靶向和物理化學靶向三種。其中，主動靶向是修飾脂質(zhì)體如微粒與配體（如單克隆抗體、縮氨酸、蛋白質(zhì)等）偶聯(lián)，以提高藥物微粒的靶向性和與靶組織的結(jié)合親和力，增加藥物在靶組織中的沉積量。目前，脂質(zhì)體與配體偶聯(lián)的方法較多，科研人員也在不斷加以改進，以提高藥物的靶向性。

非共價偶聯(lián)方法尚存不足

配體與脂質(zhì)體偶聯(lián)主要有兩種方式：共價鍵與非共價鍵偶聯(lián)。其中，直接將配體加到磷脂中，通過混合制備脂質(zhì)體的方法稱為非共價偶聯(lián)法。它具有不需偶聯(lián)劑、制備簡單的優(yōu)點，但配體與脂質(zhì)體的結(jié)合率相對較低（4%~40%），脂質(zhì)體容易發(fā)生聚集，難以控制配體在脂質(zhì)體上的數(shù)量、分布以及配體結(jié)合位點等，且配體與脂質(zhì)體易分離。將半抗原與配體結(jié)合可提高配體與脂質(zhì)體的結(jié)合率，但仍未解決脂質(zhì)體與配體結(jié)合力弱、配體在脂質(zhì)體表面隨機分布等問題。

共價偶聯(lián)方法較為看好

而以共價鍵偶聯(lián)的方法較為常用，即將脂質(zhì)體上疏水基團與配體以共價鍵結(jié)合。常用的疏水基團供體有長鏈脂肪酸（如棕櫚酸）和磷脂[如磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰纖維醇（PI）]。配體與脂質(zhì)體共價偶聯(lián)的方法有兩種：配體與偶聯(lián)劑反應(yīng)，再與脂質(zhì)體反應(yīng)，形成配體修飾脂質(zhì)體；偶聯(lián)劑與脂質(zhì)體反應(yīng)，再與配體反應(yīng)，將配體連接到脂質(zhì)體表面。

配體與脂質(zhì)體以硫醚鍵偶聯(lián)

蛋白質(zhì)中常含有巰基，巰基可與偶聯(lián)劑順丁烯二酰亞胺形成穩(wěn)定的硫醚鍵，借此蛋白質(zhì)配體與脂質(zhì)體偶聯(lián)。但有些蛋白質(zhì)上巰基缺乏或數(shù)量不足，需進行修飾，以增加巰基的數(shù)量。N-羥基琥珀酰亞胺3-（2-吡啶二硫代基）丙酸酯（SPDP）和琥珀酰亞胺-S-乙酰基硫代乙酸酯（SATA）便是常被用于增加巰基的化合物，它們含有一個伯氨基和被保護的巰基，其伯氨基先與配體蛋白質(zhì)結(jié)合后，采用二硫代蘇糖醇（DTT）或其他還原劑將被保護的巰基轉(zhuǎn)化成巰基，再與順丁烯二酰亞胺反應(yīng)，形成硫醚鍵，使蛋白質(zhì)配體偶聯(lián)到脂質(zhì)體上。國外研究人員采用半胱氨酸修飾scFv抗體，增加配體的巰基，經(jīng)順丁烯二酰亞胺與脂質(zhì)體偶聯(lián)，形成scFv抗體修飾免疫脂質(zhì)體，可與腫瘤組織產(chǎn)生的ED-B纖維結(jié)合蛋白特異性結(jié)合。

配體與脂質(zhì)體以二硫鍵偶聯(lián)

配體與脂質(zhì)體以二硫鍵偶聯(lián)是較容易的方法，但二硫鍵在血液中易被還原，使配體與脂質(zhì)體又分解。為了使配體與脂質(zhì)體形成穩(wěn)定的二硫鍵偶聯(lián)，可增加配體上的巰基，以此來增加二硫鍵，提高配體與脂質(zhì)體偶聯(lián)的穩(wěn)定性。增加配體巰基的方法可將原有的二硫鍵還原成巰基或通過SATA、SPDP在配體上引入巰基。配體上的巰基與脂質(zhì)體上的磷脂酰乙醇胺-吡啶二硫代丙酰胺(PE-PDP)偶聯(lián)劑反應(yīng)，即可形成配體-脂質(zhì)體的二硫鍵偶聯(lián)。國外研究人員采用該技術(shù)成功地將單克隆抗體[抗-GD(2)]Fab’片段與阿霉素脂質(zhì)體通過二硫鍵偶聯(lián)，制成的配體-脂質(zhì)體具有人成神經(jīng)管細胞瘤靶向性。

配體伯胺與脂質(zhì)體羧酸交叉偶聯(lián)

配體上的伯胺可通過與脂質(zhì)體上偶聯(lián)劑末端的羧基反應(yīng)形成酰胺鍵偶聯(lián)。脂質(zhì)體上偶聯(lián)劑末端的羧基先與1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳二酰亞胺（EDAC）反應(yīng)，再與配體上的伯胺反應(yīng)形成酰胺鍵。常用的偶聯(lián)劑為二硬脂酸-N-[羧基丙酰基-（聚乙烯乙二醇）-琥珀酰]磷脂酰乙醇胺（DSPE-PEG-COOH），其末端羧基有一定長度，空間位阻小，易與配體反應(yīng)，且可避免配體變性而喪失抗原特異性。國外人員采用該方法制備的鐵傳遞蛋白（TF）-脂質(zhì)體可與小鼠結(jié)腸癌細胞靶向結(jié)合，并在受體介導下被有效內(nèi)吞。另外，有人采用N-戊二基磷脂酰乙醇胺（NGPE）制備抗肌漿球蛋白抗體（AM）Fab’-脂質(zhì)體，F(xiàn)ab’片段與脂質(zhì)體的結(jié)合率為65%~75%，體內(nèi)實驗表明，AMFab’-脂質(zhì)體可選擇性地沉積在血管梗死的心肌細胞上。

配體與脂質(zhì)體羧基酯化偶聯(lián)

配體上的羥基可與脂質(zhì)體聚乙二醇（PEG）衍生物鏈末端羧基通過酯化偶聯(lián)。國內(nèi)科研人員將末端帶羧基的二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺（DPPE）PEG衍生物（DPPE-PEG3000-COOH）結(jié)合于脂質(zhì)體中，制成長循環(huán)脂質(zhì)體，再通過其羧基與配體上羥基的酯化作用，將膀胱癌單克隆抗體BDI-1或小鼠免疫球蛋白G(IgG)與脂質(zhì)體表面偶聯(lián)，制成免疫脂質(zhì)體。體外靶細胞殺傷活性檢測和小鼠組織分布試驗表明，該免疫脂質(zhì)體可選擇性殺傷人膀胱癌細胞EJ，減少脂質(zhì)體在肝、脾中的分布，延長血中滯留時間。

配體與脂質(zhì)體以腙鍵偶聯(lián)

配體上的醛基可通過與脂質(zhì)體上酰肼基反應(yīng)以腙鍵偶聯(lián)到脂質(zhì)體表面。為了避免配體失去免疫活性，可采用半乳糖氧化酶或高碘酸在溫和的條件下，將配體即免疫球蛋白長鏈上特定區(qū)域的糖基氧化成醛基，直接與脂質(zhì)體上的月桂酸酰肼反應(yīng)，形成立體穩(wěn)定的靶向脂質(zhì)體。國外有人采用該方法制備了含抗癌前藥5-氟-2’-去氧尿嘧啶的大鼠結(jié)腸腺癌單克隆抗體(抗-CC531)免疫脂質(zhì)體。它可選擇性地轉(zhuǎn)運到癌細胞表面，并內(nèi)吞入溶菌酶間質(zhì)。

抗生物素蛋白-生物素配體與脂質(zhì)體偶聯(lián)

抗生物素蛋白-生物素技術(shù)是制備藥物配體靶向制劑的一個非常有用的方法，它可分步將抗生物素蛋白和生物素偶聯(lián)到脂質(zhì)體上。偶聯(lián)后的抗生物素蛋白或生物素抗體仍具有免疫活性，且在短時間內(nèi)不被吞噬，能多途徑與靶細胞結(jié)合，增加靶向性。有研究人員首先制備了含生物素-氨基-乙酰基雙十六?；字Ｒ掖及返闹|(zhì)體，然后分別與生物素CA-125(CancerAntigen125)抗體和生物素蛋白鏈菌素抗體偶聯(lián)，形成免疫脂質(zhì)體。體外實驗表明，它可選擇性地結(jié)合到高表達CA-125抗原的OVCAR-3細胞上。

在過去的幾十年，靶向脂質(zhì)體的研究成為先進遞藥技術(shù)的熱點。無論從活性基團的選擇、修飾方法的發(fā)明、靶向作用的檢測，還是體內(nèi)藥代、藥效研究和臨床應(yīng)用都取得了非常可喜的成績，特別是對于基因藥物制劑有著其他方法不可替代的優(yōu)點?？梢灶A見，經(jīng)過人們的不斷努力和探索，將來一定可以做到定點、定時、定量控釋給藥，為臨床治療不同疾病提供更好的選擇。