35年狼瘡性腎炎臨床與基礎(chǔ)研究

摘要　本研究在國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)異常增高的循環(huán)白介素-6可導(dǎo)致狼瘡性全身性病理損害；白介素-6異常增高在狼瘡性小管間質(zhì)損害過程中可能具有重要作用；白介素-6及其信息傳遞中的GP130,JunB基因異常表達參與了彌漫性增生性狼瘡性腎炎(LN)分子發(fā)病過程，并率先發(fā)現(xiàn)丹參通過增強c-myc蛋白高水平表達而誘導(dǎo)細胞凋亡，從而對人腎成纖維細胞增殖產(chǎn)生抑制作用。在國內(nèi)外首次證實巨噬細胞在LN的病人腎臟局部增殖，且和疾病嚴重程度呈正相關(guān)。首次發(fā)現(xiàn)白介素受體(sIL-2R)和FLCT增多是診斷早期活動LN的可靠指標。篩選并建立了一種本病活動性的計分方法；發(fā)現(xiàn)小管間質(zhì)病變分級對LN腎小球病理、臨床表現(xiàn)、治療、療效及復(fù)發(fā)的判斷均有指導(dǎo)意義。在國內(nèi)首先報道超大劑激素沖擊療法治療嚴重的活動性LN，率先提出適合我國國情的改進CTX沖擊療法治療LN。發(fā)現(xiàn)中藥在促進骨髓造血，對抗CTX等致免疫功能過度抑制具有一定作用。首次在國內(nèi)探討了LN尿毒癥的可逆性，并分析發(fā)現(xiàn)SLE死亡最主要原因并非尿毒癥。

狼瘡性腎炎(LN)是一種臨床常見的自身免疫性疾病，嚴重影響著人民的健康。由于其診斷治療較為棘手，發(fā)病機制仍不明確，因此LN的研究一直受到國內(nèi)外學(xué)者的重視［1～9］，我們課題組對此病作了30多年的臨床和實驗研究，于1963年在國內(nèi)最早分析了當時國內(nèi)最大組別的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)［10］，以后不斷地進行臨床觀察和研究。近年來隨著細胞分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，我們對其分子發(fā)病機理與臨床進行了綜合研究，現(xiàn)總結(jié)如下。

1　發(fā)病機理

1.1　白細胞介素-6

白細胞介素-6(白介素-6)與LN發(fā)病機理仍然尚不十分清楚，為了確定LN病人體內(nèi)是否存在內(nèi)源性白介素-6表達增高及其來源，我們應(yīng)用ELISA法檢測58例LN病人的血清及外周血單個核細胞(PBMC)內(nèi)白介素-6蛋白的水平［11］，在國內(nèi)首次采用原位雜交方法結(jié)合IBAS2.0圖像分析系統(tǒng)，檢測其中20例LN病人PBMC在未受任何刺激時白介素-6mRNA表達強度，并分析3者之間的關(guān)系。結(jié)果表明該3者水平在LN病人體內(nèi)均異常增高，活動期尤其明顯，3者之間互呈直線正相關(guān)。提示LN病人PBMC內(nèi)源性過度表達和合成白介素-6是其外周白介素-6水平增高的原因之一，異常增高的循環(huán)白介素-6對狼瘡性全身性病理損害，尤其對腎損害具有重要的作用，同時證明血清白介素-6增高可提示LN處于活動期，對臨床指導(dǎo)治療有一定意義。另外，我們探討了白介素-6在狼瘡性小管間質(zhì)病變中的作用［12］，通過檢測42例活動期LN患者尿白介素-6水平與其中的15例腎小管間質(zhì)白介素-6mRNA水平，發(fā)現(xiàn)42例活動期LN患者中有36例尿白介素-6肌酐比值＞5ng/mg，其增高程度與尿微球蛋白(β2-MG)及NAG酶活性水平呈顯著正相關(guān)；在15例腎組織切片中，腎小管間質(zhì)均有白介素-6mRNA表達，小管間質(zhì)病變愈嚴重，其表達量愈高，而健康腎組織小管間質(zhì)幾乎無白介素-6mRNA表達。提示LN患者活動期尿白介素-6水平異常增高與腎小管間質(zhì)白介素-6mRNA異常表達有關(guān)，白介素-6在狼瘡性小管間質(zhì)損害過程中可能具有重要作用。

有關(guān)白介素-6信號傳遞系統(tǒng)中GP130和JunB是否參與了彌漫性增生性LN的分子病理過程目前國內(nèi)外尚無報道。我們采用原位雜交技術(shù)觀察了20例彌漫性增生性LN患者腎活檢組織腎小球細胞中白介素-6、GP130和JunB mRNA表達，并分析其與患者腎小球系膜區(qū)增寬和尿蛋白之間的關(guān)系［13］，結(jié)果在國內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)彌漫性增生性LN患者白介素-6、GP130JunB基因mRNA表達分別是6.6±0.9，8.6±0.9和6.7±0.8，較對照組明顯增加(P＜0.01)；白介素-6、GP130mRNA表達與系膜區(qū)增寬和尿蛋白排泄量呈正相關(guān)。提示白介素-6及其信息傳遞中的GP130和JunB基因異常表達在彌漫性增生性分子發(fā)病機理中起一定作用，為LN的分子病理機制提供了新的實驗依據(jù)。

1.2　細胞凋亡

近年來，細胞凋亡理論的引入為LN發(fā)病機制的研究開拓了一個新的領(lǐng)域。LN與細胞凋亡之間具有密切的相關(guān)性［14］。我們率先在國內(nèi)成功分離培養(yǎng)LN患者腎活檢組織的成纖維細胞，探索環(huán)磷酰胺能否通過誘導(dǎo)細胞凋亡來減輕纖維化病變，觀察環(huán)磷酰胺衍生物4-氫過氧環(huán)磷酰胺(4-hydroperoxycyclophosphamide,4-HC)對LN患者腎間質(zhì)成纖維細胞凋亡的影響［15］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4-HC可明顯促進其凋亡，這為臨床應(yīng)用環(huán)磷酰胺治療LN、減輕腎間質(zhì)纖維化和延緩腎功能惡化，提供新的實驗證據(jù)。另外檢測了丹參(ρ=10g/L或20g/L)對人腎成纖維細胞氚標記胸苷(3H-TdR)摻入率的影響，并用流式細胞儀檢測細胞的程序性死亡(programmed cell death)即凋亡(apoptosis)［16］，結(jié)果顯示：丹參對人腎成纖維細胞增殖有抑制作用，且呈劑量依賴性。流式細胞儀檢測程序性細胞死亡結(jié)果表明，丹參可促使人腎成纖維細胞發(fā)生程序性死亡，呈劑量依賴性。丹參通過使c-myc蛋白高水平表達而誘導(dǎo)細胞凋亡，從而對人腎成纖維細胞增殖有抑制作用。

1.3　巨噬細胞

巨噬細胞的局部增殖在LN發(fā)病機制中的作用尚無人報道［17］。在LN性腎炎的腎病理組織切片中發(fā)現(xiàn)許多巨噬細胞，傳統(tǒng)觀點認為腎臟中的巨噬細胞來源于血液的單核細胞，這些巨噬細胞在腎組織中不再增殖。我們的研究在世界上首先發(fā)現(xiàn)巨噬細胞在LN病人腎臟局部增殖，其增殖程度和疾病嚴重程度呈正相關(guān)，例如在Ⅳ型LN，增殖的巨噬細胞明顯多于Ⅱ型LN［18，19］。提示巨噬細胞局部增殖在LN的致病中起重要的作用，同時也為尋找新的治療手段提供了新線索。由于巨噬細胞局部增殖使炎癥反應(yīng)放大，如能抑制巨噬細胞的局部增殖，使能有效地抑制疾病的進展［20］。

2　臨床研究

2.1　臨床表現(xiàn)與病理

臨床上我們對LN特點進行了全面和系統(tǒng)的臨床觀察，包括對老年LN［21］、兒童LN［22］和SLE臨床免疫學(xué)特征［23］進行了研究。發(fā)現(xiàn)LN仍以女性為主，但臨床免疫學(xué)特征也有差異。通過對66例男性和463例女性患者臨床特點的比較，發(fā)現(xiàn)男女之比為1∶7，男性出現(xiàn)腎損害的間隔時間短于女性(P＜0.05)，以腎損害為首發(fā)癥狀者較女性多見(P＜0.05)；男性脾腫大、盤狀紅斑等癥狀高于女性(P＜0.05)，但關(guān)節(jié)痛、蝶形紅斑等低于女性(P＜0.05)；男性死亡率Ⅴ型LN發(fā)病率高于女性［24］。另外對152例LN的呼吸系統(tǒng)臨床表現(xiàn)［25］、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)肺胸膜病變［26］和LN并腎性尿崩癥［27］也進行了觀察研究。對SLE患者心臟病變也進行了研究［28］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有超聲心動圖異常的79例(61.24%)，其中瓣膜異常52例，心包積液36例，心肌異常24例，兼有不同程度的瓣膜、心肌或心包病變者34例，有抗磷脂抗體的患者心瓣膜損害的發(fā)病率較高(67.3%)，提示這種抗體在SLE患者心瓣膜病變的發(fā)病機制中可能有促進作用。我們曾報道了SLE的臨床免疫學(xué)特征，例如抗Rib-P是診斷SLE的重要指標，但我們首次發(fā)現(xiàn)抗Rib-P陽性和陰性組腎損害無明顯的差別，它與SLE神經(jīng)系統(tǒng)損害和關(guān)節(jié)炎等關(guān)系密切［29］，通過對130例與160例LN免疫血清指標進行觀察［30］，結(jié)果進一步證實：①抗Sm抗體與疾病活躍程度相關(guān)，可作為判斷病情、監(jiān)測療效的血清學(xué)指標；②抗Sm抗體陽性常伴內(nèi)臟病變、皮膚損害嚴重，易脫發(fā)；③抗Sm抗體為標記性抗體，對SLE診斷特異性很高，此與國內(nèi)外報道相似。我們也報告了經(jīng)腎活檢診斷的75例LN，分析了其臨床、實驗室和病理檢查資料［31］，結(jié)果病理類型以彌漫增生型最多，活動性指數(shù)的病理積分也以該型最高，此與國內(nèi)外的認識一致。另外對系統(tǒng)性紅斑狼瘡的誤診進行了分析［32］，這些觀察極大地豐富了LN腎外臨床表現(xiàn)的研究內(nèi)容，補充了SLE的臨床研究的某些空白點。

2.2　活動指標

LN活動指征的判定對診治本病具有非常重要的意義。為了尋找更加準確合理地評估SLE(LN)活動的客觀指征，我們在國內(nèi)首次對30例LN患者尿中內(nèi)白介素-2受體(IL-2R)和免疫球蛋白自由輕鏈(FLCT)進行了觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)sIL-2R和FLCT增多是診斷活動LN早期可靠指標［33～35］，研究了尿白介素-6檢測在SLE病情判斷中的價值［36］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各型LN患者尿白介素-6水平均明顯升高，其中隱匿型尿白介素-6水平已有明顯升高，腎功能不全型尿白介素-6水平顯著高于隱匿型、腎炎型或腎病綜合征型?；顒悠贚N患者尿白介素-6水平顯著高于非活動期，經(jīng)治療后明顯降低，復(fù)發(fā)時重新升高。WHO Ⅳ型LN患者尿白介素-6水平明顯高于其他病理類型。此外，尿白介素-6水平與血清白介素-6水平不相關(guān)，但與抗dsDNA抗體相關(guān)。因此提示尿白介素-6檢測可作為LN早期診斷、活動性監(jiān)測、療效及復(fù)發(fā)判斷的非創(chuàng)傷性生化指標之一，并可部分替代腎活檢。另外我們觀察了LN活動期和環(huán)磷酰胺(CTX)加激素沖擊治療后8周患者晨尿白介素-8水平的變化［37］，以治療穩(wěn)定期的LN患者作對照，發(fā)現(xiàn)LN活動期患者尿白介素-8水平顯著高于穩(wěn)定期LN患者；CTX加激素治療8周后的白介素-8水平顯著低于治療前，狼瘡活動的臨床癥狀和生化指標明顯好轉(zhuǎn)，提示尿白介素-8水平與LN的病變活動密切相關(guān)，并可作為LN活動和預(yù)后評估的一個重要參數(shù)。在國內(nèi)首次以臨床醫(yī)師的判斷作為疾病活動程度的外部標準，對117例LN患者的資料進行單因素相關(guān)分析和多元回歸分析，篩選出了與LN疾病活動程度相關(guān)性最好的臨床與實驗室指標，并建立了一種疾病活動性的計分方法［38］。結(jié)果篩選出14個最能提示疾病活動性的參數(shù)，并以各參數(shù)在多元回歸分析中的回歸系數(shù)作為其各自的加權(quán)分(略加簡化)，建立的這種LN疾病活動程度的計分方法，即活動性指數(shù)，它能較簡便、合理、有效地測定LN的活動程度。我們也探討了經(jīng)腎活檢的75例LN，并分析了其臨床、實驗室和病理檢查資料［39］。全部病例的腎活檢結(jié)果均有腎臟的免疫病理學(xué)及組織病理學(xué)異常。病理類型以彌漫增生型最多，活動性指數(shù)的病理積分也以該型最高。LN的臨床表現(xiàn)、實驗室檢查與病理類型有一定的相關(guān)性，通過觀察不同病理類型LN的腎損害表現(xiàn)及實驗室特點，提出了根據(jù)LN臨床表現(xiàn)和實驗室檢查結(jié)果，可以大致推測其病理類型，估計腎損害的嚴重程度，以指導(dǎo)治療，判斷預(yù)后。對LN患者腎小管間質(zhì)病變(TIL)病理分級與臨床的關(guān)系也進行了研究［40］，發(fā)現(xiàn)活動性LN中TIL發(fā)生率高，小管功能改變較早，發(fā)生率相對較高。提示小管間質(zhì)病變分級對LN腎小球病理、臨床表現(xiàn)、治療、療效及復(fù)發(fā)的判斷均有指導(dǎo)意義。

2.3　治　療

以前腎上腺皮質(zhì)激素一直是治療的主要方法。我們在國內(nèi)較早系統(tǒng)地介紹并應(yīng)用此類方法治療LN［41～47］。曾于1983年首次報道超大劑量激素沖擊療法治療嚴重的活動性LN6例［48］，療效滿意，即采用甲潑尼龍1g/d或地塞米松150mg/d，加入50g/L葡萄糖液300ml中靜脈滴注，每d1次，3d為1療程。然后口服潑尼松40～60mg/d，4周后逐漸減量，至維持量，必要時，隔2周可重復(fù)使用沖擊療法。1991年我們率先提出LN治療上的新概念，應(yīng)著重使用環(huán)磷酰胺，在國內(nèi)外首創(chuàng)適合我國國情的改進CTX沖擊療法治療LN［49，50］，在急、重癥LN治療的初期，靜脈注射CTX以每2周1次，每次8～12mg/kg，連用2d，有利于及時緩解病情，提高療效，治療后病情減輕時改為每月1次，如果狼瘡活動基本控制后應(yīng)以每3個月1次，以鞏固療效，這些研究結(jié)果已廣泛的被國內(nèi)同行認同和采用，部分內(nèi)容已成為國內(nèi)目前治療本病的常規(guī)方法。并首次報道環(huán)磷酰胺大劑量沖擊治療LN并發(fā)狼瘡腦炎見效快，副作用少，優(yōu)于以往的激素療法［51］，同時報道了狼瘡性腎炎所致腎病綜合癥的治療［52］，最近我們探討了不同活動程度的重癥LN患者使用環(huán)磷酰胺沖擊治療的最佳間期與合理劑量［53］，也研究了小劑量環(huán)孢霉素A(CsA)與環(huán)磷酰胺(CTX)治療比較，結(jié)果兩者總體療效相當［54］。LN所致的尿毒癥，過去一直認為是不可逆轉(zhuǎn)而放棄治療，僅以透析維持生命，我們在國內(nèi)率先介紹了狼瘡性腎炎尿毒癥的新療法［55］并報道了狼瘡性腎炎尿毒癥的可逆性的研究，以激素和環(huán)磷酰胺治療17例透析中的LN患者，16例獲得成功［56］。我們研究發(fā)現(xiàn)在下列情況：尿毒癥早期(病史小于2年，影像學(xué)檢查雙腎未縮小，腎功能急劇惡化，有狼瘡活動者)的病人，在腹膜透析的基礎(chǔ)上，可用標準激素療法及環(huán)磷酰胺(CTX)治療。另外我們研究發(fā)現(xiàn)在腹膜透析或血液透析輔助治療下激素和細胞毒性藥物(環(huán)磷酰胺)對狼瘡腎炎(LN)尿毒癥的逆轉(zhuǎn)具有重要作用，但腹膜透析組的療效明顯優(yōu)于血液透析組［57］，其原因可能與腹膜透析的特點有關(guān)，腹膜透析是一種接近生理狀態(tài)的透析方法，能保護殘存腎功能［58］，提示有LN尿毒癥者應(yīng)盡可能選擇腹透作輔助治療。

中西醫(yī)結(jié)合治療LN是我們臨床研究的重要內(nèi)容之一，我們的成果受到國內(nèi)外學(xué)者的重視和引用［59，60］。我們較早介紹并應(yīng)用了中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合治療LN，提出進一步開展中西醫(yī)有機地結(jié)合治療LN的研究［3，61～63］，為我國中西醫(yī)結(jié)合研究本病提供了新的思路；并較早開展了系列研究，包括中西醫(yī)結(jié)合治療重癥LN［64］、LN急進型［65］和LN并發(fā)帶狀皰疹［66］。通過對LN采用中西結(jié)合方法治療并與單純用西藥治療進行對照觀察，結(jié)果顯示中西結(jié)合治療組的總有效率高于對照組［67］，初步顯示中西醫(yī)結(jié)合組在提高療效、減少復(fù)發(fā)和減少副作用方面，均優(yōu)于西醫(yī)組［68］；首次發(fā)現(xiàn)中藥在促進骨髓造血［69］、對抗CTX等致免疫功能過度抑制具有一定作用［70］。對LN尿毒癥研究方面，顯示在腹膜透析下用中西醫(yī)結(jié)合方法治療較單純采用西醫(yī)治療的效果好［71］。

2.4　預(yù)后

對LN預(yù)后也作了較深入系統(tǒng)的研究，例如采用非參數(shù)乘積限估計法分析生存率COX模型分析預(yù)后因素，調(diào)查了588例患者的長期存活率并分析影響存活率的預(yù)后因素，結(jié)果LN病人1、5、10、13年存活率分別為88.0%、74.2%、59.1%及53.4%。影響生存的因素有血清肌酐≥12μmol/L，尿細胞管型，系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動指數(shù)(SLEDAI)≥20分，年齡≤15歲，合并感染及腎臟病理WHO分型Ⅳ型，其中，血清肌酐升高及狼瘡活動指數(shù)≥20分是獨立的預(yù)后影響因素，激素加環(huán)磷酰胺治療能提高存活率［72］，提示腎臟受損及狼瘡活動程度是影響LN預(yù)后的重要因素，積極的免疫抑制治療有利于改善預(yù)后。這是目前國內(nèi)最大的病例樣本數(shù)和觀察時間最長的病例。

另外我們對465例SLE患者中的90例死者死因進行分析［73］，結(jié)果最主要死因是SLE本身40例(44.44%)，其次是感染30例(33.33%)，心血管疾病12例(13.33%)，SLE與感染致死較常發(fā)生于年輕患者，SLE死亡多發(fā)生在診斷后的頭3年，SLE死亡最主要原因是SLE本身。故對SLE活動應(yīng)積極治療，但不能過度，以免引發(fā)感染而死亡。

我們首次在國內(nèi)探討了LN尿毒癥的可逆性［74］，在15年中37例已開始進行透析的LN患者，予以積極的激素和CTX治療，結(jié)果83.8%的患者脫離了透析，停止透析平均時間為(40.6±21.5)個月，停止透析半年以上的血肌酐值平均為(179.36±88.24)μmol/L。提示需要透析的LN患者，并不等于終末期腎病；在有適應(yīng)癥時，經(jīng)積極治療，腎衰有逆轉(zhuǎn)的可能［75］。以往認為LN死亡的主要的原因是尿毒癥，我們通過對586例LN中死亡的119例進行死因分析，發(fā)現(xiàn)各器官受累的常見程度依次為腎、腦、肺、肝，主要原因并非為尿毒癥［76］，這些研究對改善本病的預(yù)后，正確判斷預(yù)后具有一定的重要作用。