《中國生物制品規(guī)程》 凍干基因工程α1b干擾素制造及檢定規(guī)程

本品系用從健康人白細胞中獲得的α1b干擾素基因重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染大腸桿菌，使之高效表達人α1b干擾素，經(jīng)高度純化后凍干制成。用于治療慢性乙型肝炎、丙型肝炎和毛細胞白血病等疾病。

1　菌種

1.1菌種來源

系帶有人α1b干擾素基因的pBVXα1b質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM103株。投產(chǎn)的工程菌需經(jīng)衛(wèi)生部批準。

1.2菌種特性

菌種表達穩(wěn)定，表達水平符合投產(chǎn)菌種要求。

1.3制造用菌種庫的建立

從原始菌種庫傳出，經(jīng)擴大后凍干保存，或由上一代制造用菌種庫傳出，擴大后凍干保存作為制造用菌種庫，但每次只限傳三代。每批制造用菌種庫均應(yīng)進行下列檢定，合格后方可投產(chǎn)。

1.3.1劃種LB瓊脂平板

應(yīng)呈典型大腸桿菌集落形態(tài)，無其他雜菌生長。

1.3.2涂片革蘭氏染色

在光學顯微鏡下觀察應(yīng)為典型的革蘭氏陰性桿菌。

1.3.3對抗生素的抗性

應(yīng)與原始菌種相符。

1.3.4電鏡檢查

應(yīng)為典型大腸桿菌形態(tài)，排除支原體、病毒樣顆粒及其他微生物污染。

1.3.5生化反應(yīng)

應(yīng)符合大腸桿菌生物學性狀。

1.3.6干擾素表達量

在搖床中培養(yǎng)，應(yīng)符合原始菌種的表達量。

1.3.7表達的干擾素型別

應(yīng)用標準抗α型干擾素血清作中和試驗，證明型別無誤。

1.3.8質(zhì)粒檢查

應(yīng)做該質(zhì)粒的酶切圖譜，應(yīng)與原始質(zhì)粒相符。

1.4種子液制備

1.4.1菌種傳代用LB培養(yǎng)基

液體LB培養(yǎng)基不含瓊脂，供搖床培養(yǎng)用，含2%瓊脂供制備平板和斜面用，含0.5%瓊脂的半固體供短期保存菌種用。

1.4.2生產(chǎn)菌種的制備和檢定

取制造用菌種庫凍干菌種，開啟后劃種培養(yǎng)基平板2～3塊，培養(yǎng)后挑取平板中典型集落8～10個，分別培養(yǎng)后保存，然后分別進行干擾素表達量測定，至少重復一次，先其中干擾素表達量最高的一份供生產(chǎn)制備種子液用，其表達量應(yīng)符合原始菌種庫的表達量，所表達的干擾素應(yīng)用標準抗α型干擾素血清作中和試驗，證明型別無誤。

1.4.3種子液的制備

將菌種接種M9CA培養(yǎng)基，在搖床中培養(yǎng)至OD值在0.4～0.8之間即可供發(fā)酵罐接種用。種子液應(yīng)進行質(zhì)粒穩(wěn)定性檢查。

2　發(fā)酵

2.1每次發(fā)酵前必須進行一次空罐滅菌。

2.2發(fā)酵用GMD培養(yǎng)基，用蒸餾水配制，其中不含有任何抗生素，配制后進行實罐滅菌。

2.3發(fā)酵溫度為36.5±0.1℃，根據(jù)工程菌生長情況到后期可適當調(diào)整溫度，并作必要的培養(yǎng)基成分添加，發(fā)酵時間根據(jù)工程菌生長情況確定。發(fā)酵結(jié)束時放出菌液，發(fā)酵灌應(yīng)再進行一次滅菌并清洗。

3　收菌

用離心法收取菌體，稱重，容器上標明批號、罐別、重量、日期。收獲的菌體如在24小時內(nèi)破菌裂解可保存于4～8℃冷庫，否則應(yīng)置?/FONT>30℃凍存。

4　菌體裂解與粗制干擾素制備

用高壓勻漿法裂解菌體，將菌體作成10%～20%的懸液進行高壓勻漿，壓力50Mpa/cm2，連續(xù)勻漿二次，勻漿后的懸液離心后取上清即為粗制干擾素。

5　濃縮與純化

5.1初步純化

采用不同原理多步驟的方法，使初步純化的干擾素達到外觀無色透明，無絮狀物，比活性在105IU/mg蛋白以上，并將其濃縮至原體積的1/10～1/20，保存于4℃，如3天內(nèi)不能進行高度純化，應(yīng)凍存于?/FONT>30℃冰箱內(nèi)。

5.2高度純化

經(jīng)初步純化后進行高度純化，去除絕大部分非干擾素蛋白，使其達到本規(guī)程7～8項要求。高度純化應(yīng)在潔凈度為10000級的恒溫（15～18℃）室內(nèi)進行。

5.3在高度純化過程中應(yīng)進一步濃縮，使體積為初步純化干擾素的1/5～1/10。并應(yīng)轉(zhuǎn)換緩沖液系統(tǒng)，使之適合于人體注射用。

5.4在整個濃縮與純化過程中不得加入對人體有害的物質(zhì)。

5.5在濃縮純化過程中應(yīng)特別注意去除熱原質(zhì)，用于分子篩層析的溶液，配合后應(yīng)進行去除熱原質(zhì)處理。容器應(yīng)干熱滅菌，不能干熱滅菌者應(yīng)用適當濃度的NaOH處理。

5.6濃縮純化最后所得的純化干擾素即為“半成品原液”，取樣進行7.1～7.4項檢定后，立即加入人白蛋白，使其最終含量為2%，稱為“加白蛋白半成品”，取樣測定干擾素效價，其余凍存于－30℃冰箱中，應(yīng)盡量避免凍融。

5.7所用的人白蛋白應(yīng)符合相應(yīng)規(guī)程要求，HBsAg。

6　稀釋、除菌過濾

6.1將檢定合格的加白蛋白半成品以乳徑為0.22μm的濾膜除菌過濾，除菌后立即進行稀釋。

6.2稀釋液制備

用合格的蒸餾配制生理鹽水，經(jīng)高壓滅菌，加入檢定合格的注射用人白蛋白，使最終含量為2%，即為稀釋液。配制后應(yīng)立即用于稀釋。

6.3稀釋

除菌后加白蛋白半成品用稀釋液稀釋至所需濃度。稀釋后用孔徑為0.22μm濾膜過濾除菌，保存于4℃，并取樣作無菌試驗和熱原試驗，合格后進行凍干。

7　半成品檢定

每批半成品抽樣進行7.1～7.7項檢定。啟開新菌種生產(chǎn)的前3批或生產(chǎn)條件有較大改變時進行7.8～7.12項檢定。

7.1效價測定

用細胞病變抑制法，Wish細胞/VSV為檢測系統(tǒng)。用國家參考品校準為IU。

7.2蛋白含量

用Lowry法測定。同批不同階段的樣品比較時應(yīng)盡可能同時測定。

7.3比活性

根據(jù)效價測定及蛋白含量計算比活性，本品的比活性應(yīng)在107IU/mg蛋白以上。

7.4純度

7.4.1電泳純度

用非還原型SDS?/FONT>PAGE法，加樣量不低于5μg，經(jīng)掃描儀掃描，純度應(yīng)在95%以上，聚合體不得超過10%。

7.4.2高效液相色譜純度

用280nm檢測，應(yīng)呈一個吸收峰，或主峰占總面積95%以上。

7.5分子量測定

用還原型SDS?/FONT>PAGE法。加樣量不低于5μg。制品的分子量與理論值比較，誤差不超過10%。

7.6殘余外源性DNA含量

用固相斑點雜效法，以地高辛標記的核酸探針法測定，其含量應(yīng)少于100pg/劑量。

7.7殘余IgG含量

如采用單克隆抗體親和層析法純化，應(yīng)進行本項檢定。采用ELISA雙抗體夾心法測定，IgG含量應(yīng)少于100ng/劑量。

7.8殘余工程菌蛋白含量

用酶標法或其他敏感方法測定，殘余工程菌蛋白不得超過總蛋白的0.02%.

7.9抗生素活性

半成品中不應(yīng)有殘余氨芐青霉素活性。

7.10肽圖測定

應(yīng)符合α1干擾素的圖形，批與批之間圖形應(yīng)一致。

7.11等電聚集

測定等電點，應(yīng)有固定的范圍（4.0～6.5之間）。

7.12紫外光譜掃描

檢查半成品的光譜吸收值，批與批之間應(yīng)一致，應(yīng)有固定的最大吸收值。

8　除菌半成品檢定

8.1效價測定

同7.1項。

8.2無菌試驗

按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。

8.3熱原質(zhì)試驗

按《生物制品熱原質(zhì)試驗規(guī)程》進行。每只家兔靜脈注射干擾素5萬，判定標準按該規(guī)程4.1項要求進行。

9　成品檢定

9.1處觀

應(yīng)為微黃色薄殼狀疏松體，加入1ml蒸餾水后溶解迅速，不得含有肉眼可見的不溶物。

9.2　pH值

pH值應(yīng)為6.5～7.5。

9.3無菌試驗

同8.2項。每批抽樣不少于10支。

9.4水分

應(yīng)≤3%。

9.5熱原質(zhì)試驗

同8.3項。

9.6價測定

同7.1項。效價應(yīng)為標示量的80%～150%。

9.7安全試驗

9.7.1豚鼠試驗

用體重300～400g豚鼠2只，每只腹側(cè)皮下注射1ml（于1ml生理鹽水內(nèi)），觀察7天，豚鼠應(yīng)健存，每只體重增加判為合格。

9.7.2小白鼠試驗

用體重18～20g小白鼠5只，每只腹腔注射0.5ml（于0.5ml生理鹽水內(nèi)），觀察7天，動物應(yīng)健存，每只體重增加判為合格。

10規(guī)格

10μg/瓶，20μg/瓶和30μg/瓶。

11保存與效期

保存于2～8℃，自效價檢定合格之日起效期為2年6個月。