脾虛模型實(shí)驗(yàn)研究方法概述

自1979年北京師范大學(xué)首家報(bào)道脾虛動(dòng)物模型研制以來，脾虛動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究工作取得了較豐富的經(jīng)驗(yàn)。從最早的大黃致腹瀉模型到最近常用的多因素模型，以及病證結(jié)合模型，雖然思路不同、方法有異，但其研究方法在脾虛動(dòng)物模型的不同研究階段都起到一定的推動(dòng)作用，為脾虛證的認(rèn)識(shí)積累了寶貴資料。1以中醫(yī)理論體系中的“證”為基礎(chǔ)而復(fù)制的病因模型動(dòng)物模型造模方法是以中醫(yī)“證”的特點(diǎn)為研究思路，理論依據(jù)為中醫(yī)文獻(xiàn)中導(dǎo)致脾虛的有關(guān)論述。如“飲食自倍，腸胃乃傷”(《素問·痹論》)，“味過于酸，……脾氣乃絕，，(《素問·生氣通天論》)，“勞則氣耗”(《素問·舉痛論》)。以及“谷不入，半日則氣虛，一日則氣少”；李時(shí)珍對(duì)大黃“其性苦寒，能傷元?dú)夂年幯钡恼撌?；李杲：“大忌苦寒之藥損其脾胃”；《景岳全書》云：“凡失饑傷飽，損及脾胃，多令人胸膈痞悶，不能消化，飲食少思，口中無味，或噯氣吞酸，神體困倦，此皆脾氣受傷，中虛而然。”以及《本草經(jīng)疏》中“脾虛忌下、降泄、破氣”等理論。造模方法從單因素發(fā)展為多因素，主要有以下幾方面。1．1藥物因素造模 其中絕大多數(shù)為苦寒瀉下法。苦寒瀉下法中最常用的藥物為大黃、芒硝、番瀉葉、大承氣湯等。在苦寒瀉下的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步衍生了采用破氣、降氣的枳實(shí)、厚樸、檳榔等，或制成煎劑灌胃，或制成藥化飼料喂養(yǎng)。1．1．1大黃脾虛證動(dòng)物模型 大黃脾虛模型是我國(guó)最早的脾虛模型之一，應(yīng)用時(shí)間長(zhǎng)，比較普及，并積累了較多的實(shí)驗(yàn)研究資料。其具體操作方法為：取體重18～20g小鼠，以100％大黃水煎液(1ml／只)灌胃，連續(xù)8d；或用大鼠每次灌胃200％大黃水浸煎劑(2．O～2．5ml)，每日2次，連續(xù)10d；或用大鼠每次灌胃15％大黃粉懸液(3～5ml)，每日2次，連續(xù)14d。1．1．2番瀉葉脾虛證動(dòng)物模型Wistar大白鼠，體重(220±50)g。將自來水放入燒杯中煮沸后，迅速將印度產(chǎn)番瀉葉以20ml水中放入1g番瀉葉的比例投入沸水中浸泡，冷卻后使用，按每日20ml／kg，2次／d的量給予番瀉葉浸劑灌服，連續(xù)20d。李氏等分別用大黃、玄明粉、番瀉葉、大黃加玄明粉灌胃，持續(xù)30d，成功地研制了脾虛泄瀉證大鼠模型，并認(rèn)為番瀉葉是復(fù)制脾虛泄瀉動(dòng)物模型的首選藥物。曲氏等通過對(duì)苦寒瀉下兩種脾虛模型免疫學(xué)的比較研究，說明掌葉大黃的瀉下作用較緩且因鞣質(zhì)含量較高，在產(chǎn)生瀉下作用后又可出現(xiàn)便秘；而番瀉葉瀉下作用相對(duì)較強(qiáng)。此外，大黃還含有抗細(xì)菌、抗病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力的有效成分，能使機(jī)體暫時(shí)出現(xiàn)免疫力下降的因素與之相對(duì)峙；而番瀉葉獨(dú)歸大腸、專于瀉下、純?yōu)a無補(bǔ)，從而進(jìn)一步說明番瀉葉可作為苦寒瀉下動(dòng)物模型的首選藥物。1．1．3大承氣湯及加味大承氣湯復(fù)制脾虛動(dòng)物模型 郭氏等用大承氣湯加水先煎芒硝、枳實(shí)、厚樸，大黃后下略煎，兩次煎液混合，濃縮過濾，加蒸餾水配成每毫升含原藥材1g的藥液；或加味大承氣湯，芒硝、枳實(shí)、厚樸、大黃煎法同上，藥液濃縮過濾；番瀉葉加開水浸泡過濾，兩液混合，加蒸餾水配成每毫升含原藥材l g的藥液。實(shí)驗(yàn)開始1～4d，給造模組每只小白鼠每天灌服大承氣湯藥液0．5mL，5～7d每天灌服0．8ml，8～11d每天灌服加味大承氣湯藥液0．8ml。認(rèn)為其在復(fù)制脾虛證模型時(shí)，在大承氣湯基礎(chǔ)上重用大黃，加用番瀉葉效果更為理想。1．1．4耗氣破氣脾氣虛大鼠模型 闞氏等將大黃、厚樸、枳實(shí)按1：1：1的比例浸泡于冷水中30min，煮沸后再用文火煮20min，最終濃度相當(dāng)于2g／mL原藥材。每日2次，上、下午各1次；雙日喂大白菜，不限量，自由進(jìn)水，持續(xù)3周，復(fù)制了耗氣破氣脾氣虛大鼠模型。王氏等進(jìn)行驢造脾虛模型的實(shí)驗(yàn)。用厚樸、枳實(shí)、大黃(3：3：2)的比例制成散劑，按每2天1．5g／kg的劑量，用800ml保溫瓶開水浸泡10min后，冷水稀釋至溫度接近體溫，隔日灌胃1次，且灌胃當(dāng)日禁食，次日足量喂飼，連續(xù)6周，取得了理想的效果。陳氏等經(jīng)過實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，耗氣破氣方法應(yīng)作為長(zhǎng)期脾虛造模的首選方法。1．2飲食因素造模1．2．1飲食偏嗜法取體重20～37g小鼠，喂飼甘藍(lán)，每2天加喂豬脂1次(數(shù)量不限)，連續(xù)9d。黃氏等用上述方法成功地研制了飲食失節(jié)動(dòng)物模型。此外，羅氏等給大鼠第1日用50℃白酒2ml灌胃；第2日以后每日灌胃食醋2mL，持續(xù)10d，研制脾虛模型。后用四君子湯輔佐性證明。彭氏等先將黃連、苦杏仁制成100％濃度煎劑，再用黃連液 O．25ml／kg和苦杏仁0．25mL／kg，每日1次灌胃，持續(xù)15d。何氏等研制了偏食辛溫燥熱脾虛小鼠模型。每日用炒過的混合飼料喂養(yǎng)(豆餅2％、大米粉20％、米糖16％、玉米粉15％、大豆粉20％、魚粉5％、骨粉3％、食鹽1％)，同時(shí)以新鮮辣椒作為青飼料喂養(yǎng)，并喂給青菜與清潔水，持續(xù)6d。1．2．2饑飽失常法 饑飽失常法常作為復(fù)合因素造模的一個(gè)輔佐因素。方法是在連續(xù)禁食48h(不禁水)后，給予自由飲食2h。自由飲食2h的進(jìn)食量相當(dāng)于正常飲食狀態(tài)下每日飲食量的75％～80％。1．3藥物或飲食因素加勞倦因素 采用隔日喂食并震蕩器震蕩(饑飽失常結(jié)合勞倦過度)，喂食豬油、甘藍(lán)并跑步(肥甘過度結(jié)合勞倦過度)，以及用大黃、芒硝制成的藥化飼料喂養(yǎng)，同時(shí)用震蕩器震蕩。勞倦方法有多種，一般有溫水游泳法、震蕩器震蕩法、跑步機(jī)跑步法等。1．3．1瀉下加勞倦過度 小鼠游泳2～5min，以身體下沉為度，每日1次，且施100％大黃煎劑每日0．5ml／只灌胃，或施100％番瀉葉煎劑每日0．5ml／只灌胃。梁氏等每日喂足量大黃芒硝藥化飼料(大黃、芒硝、標(biāo)準(zhǔn)飼料按0．85：0．15：9．0比例均勻混合后制成藥化飼料，每克飼料含原藥材0．1g)；并于每日上午8—12點(diǎn)在振蕩器(繼電器控制，使其每振蕩20min，停振5min)上振蕩4h，共造模3周。1．3．2飲食偏嗜加勞倦過度將大鼠隔日在跑步機(jī)上跑步30min，單日精煉豬油6ml，每日2次灌胃；雙日飼大白菜，不限量，自由進(jìn)水，持續(xù)3周左右。1．3．3饑飽失常加勞倦過度 用托盤將鼠籠固定于振蕩器上，使其每振動(dòng)20min停10min，根據(jù)大鼠體重的不同，振動(dòng)6～lO h，每日1次，共振蕩8～33d。在振蕩的同時(shí)，用普通混合飼料，隔日給食，給食時(shí)保證足量。除振蕩外，其它時(shí)間自由飲水。傅氏等也用勞倦與饑飽法研制了大白鼠脾氣虛證模型。1．4藥物加飲食因素 多采用耗氣破氣加饑飽失常法。陳氏等n9]用Wistar大鼠，以厚樸、枳實(shí)、大黃(3：3：2)常規(guī)制成lkg幾煎劑，隔日灌胃1次，每次4ml／只(♂)或3ml／只(♀)，同時(shí)隔日喂飼。造模時(shí)間為26周。陳氏針對(duì)脾虛模型中存在“精氣未奪，，的問題，對(duì)脾虛證動(dòng)物模型的制造方法進(jìn)行了改進(jìn)。用體質(zhì)篩選、苦寒瀉下和耗氣破氣相結(jié)合的方法造模。選用：①用生大黃、厚樸、枳實(shí)(2：1：1)200％濃度煎劑。②用廣豆根、旋覆花、檳榔(3：1：1)制成250％濃度煎劑。藥化飼料按①方法制成750g／600ml煎液，每600ml藥液加入6000g原飼料粉中。藥化飲水：旋覆花、檳榔(1：1)于60℃水浴濃縮成16．7％(50g／300ml)煎液。造模時(shí)先采用游泳時(shí)間法測(cè)定體質(zhì)，方法是22℃水溫，游泳至連續(xù)“冒泡”5次為限，記錄游泳時(shí)間，短者(即體質(zhì)弱者)用于造模。給藥時(shí)用①和②，藥溫為4℃，交替灌胃，造模前18d，3次／d，后12d，4次／d；同時(shí)，自由喂飼藥化飼料及藥化飲水，造模時(shí)間為30d。脾氣虛證模型規(guī)范化的創(chuàng)新點(diǎn)在于將體質(zhì)篩選法運(yùn)用于建立證候模型；在耗氣破氣法的基礎(chǔ)上，將降氣法運(yùn)用于建立脾虛證模型；將廣豆根、檳榔、旋覆花等藥物運(yùn)用于建立脾虛證模型；采用“滿負(fù)荷”造模方法以求在有限時(shí)間內(nèi)使動(dòng)物達(dá)到“精氣奪”程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，自然恢復(fù)期達(dá)到78d，并超過雙倍造模時(shí)間。2據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)原理和方法造模 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病理造模是以中西醫(yī)結(jié)合為手段，借用西藥或西醫(yī)處理方法，對(duì)在脾虛證過程中所出現(xiàn)的一系列病理變化，如：?jiǎn)伟奉惤橘|(zhì)耗竭、交感神經(jīng)功能偏低、副交感神經(jīng)功能偏高、腸運(yùn)動(dòng)增加等進(jìn)行模仿，從而制造類似脾虛的癥狀。2．1利血平脾虛模型 小鼠體重20～25g，以利血平O．1mg／kg皮下注射，連續(xù)14d，即形成利血平化脾虛型小鼠，或取大鼠，肌注利血平注射液，每日0．2mg／kg，連續(xù)3d。2．2x射線照射制脾氣虛模型 選用60日齡Wistar大鼠，體重(200±30)g，單籠飼養(yǎng)，按250拉德／min照射劑量進(jìn)行腹外照射，造模時(shí)間共7d。3病證結(jié)合模型 這類模型的特點(diǎn)是既有脾虛證的各種表現(xiàn)，又有病的體征。其造模方法多先用耗氣破氣加饑飽失常或大黃煎劑灌胃造成脾虛模型，再使用西醫(yī)相關(guān)疾病動(dòng)物模型的制作方法復(fù)制病證結(jié)合模型，如用HP菌液灌胃、注射醋酸等復(fù)制大鼠幽門感染模型。病證結(jié)合模型可使中醫(yī)臨床對(duì)疾病的辨證施治有相應(yīng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)條件，特別是使中醫(yī)辨證施治新藥藥理實(shí)驗(yàn)有相應(yīng)證、病結(jié)合模型可采用；而且可克服中醫(yī)動(dòng)物模型研究虛化傾向，特別是避免中醫(yī)動(dòng)物模型難以實(shí)用的缺陷；通過證病結(jié)合研究以求對(duì)疾病研究、證候研究取得進(jìn)展。4結(jié)語(yǔ) 由于臨床研究的諸多困難，借助于動(dòng)物模型以探討脾虛證的本質(zhì)是非常必要的。動(dòng)物模型的應(yīng)用有助于嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件和按照預(yù)定的設(shè)計(jì)去做各種客觀的觀察及定量分析，即使對(duì)機(jī)體有害的因素也可進(jìn)行研究。脾虛動(dòng)物模型的造模方法經(jīng)過20多年的實(shí)驗(yàn)研究，從不同角度、不同層次進(jìn)行了探討。雖然有些實(shí)驗(yàn)研究方法尚待進(jìn)一步發(fā)展與完善，但脾虛動(dòng)物模型在不同時(shí)期促進(jìn)了脾虛證本質(zhì)研究的發(fā)展，是脾虛證研究的一個(gè)重要方面。摘自：《中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志》文/沈麗波，錢會(huì)南